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产鼠李糖脂生物表面活性剂防御假单胞菌的构建与优化

2020-12-08阅读(804)

产鼠李糖脂生物表面活性剂防御假单胞菌的构建与优化

论文摘要

鼠李糖脂（Rhamnolipid）生物表面活性剂主要通过铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）发酵法生产获得,但是铜绿假单胞菌较强的条件致病性限制了其在工业中的应用。利用基因工程手段构建一株相对安全且高效的鼠李糖脂生产菌株,是目前该领域研究的重点。本研究利用假单胞菌的重组酶系统敲除防御假单胞菌Pf-5（Pse-udomonas protegens Pf-5）的羟基脂肪酸合成编码基因pha,从而消除鼠李糖脂合成的竞争性抑制作用,增加鼠李糖脂产量。与此同时,通过两亲本接合转移的方法整合来源于P.aeruginosa PAO1的鼠李糖基转移酶基因（Rhamnosyltransferase gene,rhlAB）于Pf-5基因组中。本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因的表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了P.aeruginosa PAO1中的PRhlAB原始启动子,构建了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,p-BBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在P.protegens Pf-5中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。在LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,Pf-5/pBBR1-genta-RhlA B的鼠李糖脂产量为17.56 mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别是11.135 mg/L,441.135 mg/L,557.764 mg/L,启动子优化后鼠李糖脂产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍。进一步对工程菌株进行培养基优化,以1%的葡萄糖为碳源的LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pB-BR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为18.778 mg/L,38.859mg/L,375.742 mg/L,418.551 mg/L。在以橄榄油为碳源的LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pBB-R1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为30.208 mg/L,55.011 mg/L,937.887 mg/L,844.517 mg/L。以1%的橄榄油为碳源的PG培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为403.27 mg/L,522.034 mg/L。以1%的橄榄油为碳源的MSP培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为410.022 mg/L,586.079 mg/L。获得了最优生产鼠李糖脂工程菌Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,鼠李糖脂产量达到937.887 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR定量分析rhlAB基因,在Papra,Ptac和PrhaB启动子调控下,rhlAB基因的相对表达量分别是原始启动子调控下的0.93,2.16和2.77倍。本研究首次在防御假单胞菌Pf-5中对rhlAB基因进行了调控功能研究,利用定向遗传改造的方法成功构建了鼠李糖脂高产菌株,为实现鼠李糖脂rhlAB基因异源高效表达和合成调控奠定了相关基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 引言
  •   1.1 鼠李糖脂
  •     1.1.1 生物表面活性剂的概述
  •     1.1.2 鼠李糖脂的结构
  •     1.1.3 鼠李糖脂的生物合成
  •     1.1.4 鼠李糖脂的合成调控
  •     1.1.5 鼠李糖脂的高产策略
  •     1.1.6 鼠李糖脂的检测与分析
  •   1.2 防御假单胞菌Pf-5
  •   1.3 Red/ET重组工程
  •     1.3.1 Red/ET重组工程概述
  •     1.3.2 Red/ET重组工程的工作原理
  •     1.3.3 可诱导启动子
  •   1.4 立题依据与意义
  • 第2章 实验材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验菌株与质粒
  •     2.1.2 培养基和抗生素
  •     2.1.3 诱导剂
  •     2.1.4 寡核苷酸序列
  •     2.1.5 主要试剂
  •     2.1.6 主要仪器设备
  •     2.1.7 DNA序列分析软件
  •   2.2 基础分子生物学实验方法
  •     2.2.1 PCR反应
  •     2.2.2 酶切体系
  •     2.2.3 电转化方法
  •     2.2.4 质粒的提取以及酶切验证
  •     2.2.5 测序鉴定
  •   2.3 构建Pf-5/Δpha菌株
  •   2.4 鼠李糖脂基因整合入防御假单胞菌Pf-5 基因组
  •   2.5 同源重组构建鼠李糖脂操纵子相关的表达载体
  • apra-RhlAB'>    2.5.1 构建重组载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB
  • tac-RhlAB'>    2.5.2 构建重组载体pBBR1-kan-Ptac-RhlAB
  • rhaB-RhlAB'>    2.5.3 构建重组载体pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB
  •   2.6 鼠李糖脂表达载体转化入防御假单胞菌Pf-
  •   2.7 鼠李糖脂检测
  •   2.8 生长曲线和产鼠李糖脂曲线的测定
  •   2.9 鼠李糖脂的产物分析
  •   2.10 实时荧光定量PCR定量分析rhlAB基因
  •     2.10.1 RNA提取与鉴定
  •     2.10.2 反转录
  •     2.10.3 qRT-PCR反应
  • 第3章 结果与分析
  •   3.1 工程菌Pf-5/Δpha的鉴定
  •   3.2 工程菌Pf-5/Δpha-rhlAB的鉴定
  • apra-RhlAB的鉴定'>  3.3 表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB的鉴定
  • tac-RhlAB的鉴定'>  3.4 表达载体pBBR1-kan-Ptac-RhlAB的鉴定
  • rhaB-RhlAB的鉴定'>  3.5 表达载体pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB的鉴定
  •   3.6 Pf-5 重组工程菌的鉴定
  •   3.7 Pf-5/Δpha-rhlAB鼠李糖脂产量检测
  •   3.8 Pf-5 重组工程菌的生长曲线和产鼠李糖脂曲线
  •     3.8.1 生长曲线
  •     3.8.2 产鼠李糖脂曲线
  •   3.9 Pf-5 重组工程菌的鼠李糖脂产量检测
  •   3.10 LC-MS/MS对产物中鼠李糖脂的结构分析
  •   3.11 鼠李糖脂rhlAB基因的定量检测
  •     3.11.1 RNA的鉴定
  •     3.11.2 荧光定量PCR
  • 第4章 讨论
  •   4.1 鼠李糖脂基因异源表达宿主的探索
  •   4.2 鼠李糖脂基因表达载体的构建
  •   4.3 鼠李糖脂工程菌的培养基优化
  • 第5章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 缩略词表
  • 论文发表情况
  • 受资助的基金项目
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 谢芝玲

    导师: 张友明

    关键词: 同源重组,鼠李糖脂

    来源: 湖南师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 湖南师范大学

    基金: 科技部国际合作项目(2015DFE32850),国家自然科学基金项目(31500033),高等学校学科创新引智计划(B16030),中国博士后科学基金(2018M632669)

    分类号: Q78

    总页数: 77

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