恶臭假单胞菌S16尼古丁吡咯代谢分子机理研究

论文摘要

尼古丁是一种烟草中特有的有害且具有成瘾性的生物碱,广泛分布于烟草生产加工区域的土壤和水体中。在过去十年中,课题组深入研究了恶臭假单胞菌S16的尼古丁吡咯代谢途径,通过基因敲除、回补和异源表达等方式,对该菌株的尼古丁代谢基因簇nic2上的大多数基因进行了功能验证,从分子水平上解析了尼古丁吡咯代谢途径。但是整条代谢途径还有一个关键的功能基因pnao没有进行深入的解析。此外菌株S16尼古丁分解代谢基因簇的调控机制研究较少,仅有下游转录单元的相关研究被报道,而中上游的调控机制还没有被揭示。本论文首先对pnao基因的功能进行了深入的研究,证明了pnao基因负责将假氧化尼古丁（PN）转化生成3-琥珀酰吡啶（SP）。通过体外异源表达纯化对应的蛋白Pnao,对该酶的酶学性质和催化机理进行了深入的研究。确定了酶的最适反应条件,并发现Pnao蛋白具备一定的热稳定性,通过单点突变找到了维持热稳定性的关键氨基酸位点。通过稳定同位素标记法,直接证明了催化反应过程中,参与反应的化合物中各个原子的去向,完整解析了Pnao蛋白的催化反应过程,从而补全了菌株S16尼古丁吡咯代谢途径的缺失信息。虽然菌株S16尼古丁吡咯代谢途径已经被完全解析,各个基因的功能和催化机理也已经被报道,但是目前针对该途径的调控机理的研究还不完善。本研究解析了菌株S16尼古丁吡咯代谢途径完整的转录调控机制,研究了调控蛋白如何与启动子结合,抑制转录;以及调控蛋白如何与启动子分离,从而开启转录的完整过程。通过DNA亲和纯化实验和质谱检测技术,确认了NicR2参与了另一个启动子Pspm的转录调控。启动子Pspm负责控制的转录单元由四个基因构成（spmA,spmB,spmC和mfs）,位于nic2基因簇的中游。该转录单元所表达的蛋白可以将尼古丁中间代谢产物SP转化成6-羟基-3-琥珀酰吡啶（HSP）。通过凝胶阻滞和ITC实验,确定了启动子上的NicR2的关键DNA结合位点,并鉴定了该结合位点上各个碱基的功能,解析了NicR2与启动子相互作用的机理。在过去研究的基础上,进一步研究了已知效应物HSP的作用方式,揭示了它作为拮抗剂的准确功能:效应物HSP只能够与游离的NicR2结合,形成无法进一步结合启动子的NicR2-HSP复合物,而不能让已经结合启动子的NicR2从启动子上脱离下来。除了已知的效应物HSP之外,我们还找到了一个新的弱效应物SP,并对其功能进行了鉴定。最后在解析了RNA聚合酶与NicR2的竞争关系的基础上,构建了完整的尼古丁分解代谢的调控模型。在该调控模型的基础上,本论文还进行了合成生物学领域的相关研究,对基于尼古丁吡咯代谢途径调控模型的细菌自毁系统和尼古丁微生物传感器,进行了初步的探索。一方面,构建了以质粒pUCP18K反-Phsp-ccdB为核心的自毁系统。实验结果表明在能够进一步提高Phsp启动子活性的前提下,该系统有作为常规自毁模块的潜力。另一方面,以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因,构建了初级尼古丁微生物传感器,并对该传感器的效果进行了初步的测试。当尼古丁浓度处于0到5 g/L范围内时,该传感器的响应值均具备良好的线性关系。为了抑制野生型Phsp启动子不可避免的本底表达,提高传感器的分辨率和实用性,对该启动子进行了改造。改造后的启动子明显抑制了本底表达活性。综上所述,本论文在课题组过去研究的基础上,补全了尼古丁吡咯代谢途径的缺失信息:研究了关键脱毒基因pnao的功能和分子机理,构建了完整的尼古丁代谢基因簇的调控模型,并在此基础上进行了初步的合成生物学研究。本论文的相关成果,为实现尼古丁污染土壤和水体的生物修复,提供了相关理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词汇总
• 第一章 绪论
•   1.1 尼古丁对环境和人体的危害性
•   1.2 微生物降解尼古丁的研究介绍
•     1.2.1 吡啶代谢途径
•     1.2.2 吡咯代谢途径
•     1.2.3 吡啶-吡咯杂合代谢途径
•   1.3 尼古丁代谢相关的调控因子介绍
•     1.3.1 噬尼古丁节杆菌（Arthrobacter nicotinovarans）pAO1
•     1.3.2 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）S16
•     1.3.3 支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）
•     1.3.4 肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）D39
•   1.4 原核生物中的调控蛋白
•     1.4.1 TetR家族
•     1.4.2 AraC/XylS家族
•     1.4.3 双组份调控系统
•   1.5 课题研究意义
• 第二章 恶臭假单胞菌S16 中尼古丁降解关键脱毒基因pnao的功能研究
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验方法
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 尼古丁代谢关键脱毒基因pnao的克隆与构建
•     2.3.2 Pnao蛋白的分离纯化及聚合度研究
•     2.3.3 Pnao蛋白在不同p H条件下的活性检测
•     2.3.4 Pnao蛋白在不同金属离子条件下的活性检测
•     2.3.5 Pnao蛋白在不同温度条件下的活性检测
•     2.3.6 Pnao蛋白辅因子的鉴定
•     2.3.7 点突变
•     2.3.8 Pnao蛋白反应机理
•     2.3.9 Pnao全长蛋白晶体初筛及条件优化
•   2.4 本章小结
• 第三章 假单胞菌 S16 尼古丁代谢基因簇的调控机制研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验方法
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 确定尼古丁代谢基因簇nic2 中游基因转录单元
•     3.3.2 验证启动子Pspm的转录起始位点
•     3.3.3 验证启动子Pspm在菌株S16 中的体内活性
•     3.3.4 DNA亲和纯化获得Pspm启动子对应的阻遏型调控蛋白
•     3.3.5 验证启动子Pspm与 NicR2 的体外结合能力并确定结合位点
•     3.3.6 验证非对称回文序列上的碱基的功能
•     3.3.7 解析NicR2 效应物HSP的作用机理
•     3.3.8 验证SP作为NicR2 效应物的功能
•     3.3.9 验证RNA聚合酶在NicR2 调控模型中的功能
•     3.3.10 NicR2 调控模型
•   3.4 本章小结
• 第四章 构建基于 S16尼古丁代谢调控模型的自毁系统和尼古丁生物传感器
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验方法
•   4.3 实验结果与讨论
•     4.3.1 HSP诱导的自毁系统构建
•     4.3.2 构建以尼古丁分解代谢调控模型为基础的尼古丁微生物传感器
•     4.3.3 优化启动子Phsp
•   4.4 本章小结
• 结束语
• 工作展望
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士期间论文发表及专利申请情况
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 胡海洋

导师: 许平,唐鸿志

关键词: 尼古丁代谢,转录阻遏,分解代谢调控,假单胞菌

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q935

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.000428

总页数: 169

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