纳米硒合成菌株的筛选及产硒机理和应用研究

论文摘要

亚硒酸盐具有极强的生物毒性,一些微生物具有将有毒的亚硒酸盐还原为无毒纳米硒（Se0）的能力,被认为是生产硒纳米粒子（SeNPs）的理想手段。微生物还原法制备的纳米颗粒具有无毒、生产重现性好、易于规模化合成、形貌清晰、粒径均一等优点,已成为生产纳米颗粒的新趋势,在纳米技术、生物医学和环境修复等领域具有广阔的应用前景。国内外学者已经成功从土壤或者植物根际中,通过富集培养分离得到可以还原亚硒酸钠生成纳米硒的微生物,并显示了良好的应用前景。但是关于昆虫肠道微生物来源的亚硒酸钠还原菌株的筛选,目前尚未见报道。本研究以昆虫肠道微生物为试验材料,采用含有亚硒酸钠的培养基进行富集培养,以期从昆虫肠道内分离新的具有亚硒酸钠高效还原能力的微生物,并对其产硒机理和功能进行探讨。具体研究结果如下:（1）昆虫肠道来源亚硒酸钠还原微生物的筛选及鉴定。从富硒土壤中生存的松褐天牛肠道中初步分离出98株菌株,经ARADA分型,可以归为13个分类单元（OTUs）。对这13个OTUs代表菌株的亚硒酸钠还原能力进行复筛,并从中筛选两株对亚硒酸钠具有较高耐受性和优良转化效率的菌株。经分子生物学和生理生化鉴定,确认为:奇异变形杆菌Proteus mirabilis YC801和粪产碱菌Alcaligenes faecalis Se03。这也是首次发现这两种菌具有还原亚硒酸钠产纳米硒的能力。（2）奇异变形杆菌Proteus mirabilis YC801的亚硒酸钠还原特性及产纳米硒机理研究。在好氧条件下,该菌株能耐受100 mM的亚硒酸钠。在液体培养条件下,添加1.0 mM亚硒酸钠时,在42 h内能够将亚硒酸钠完全还原;当添加亚硒酸钠浓度达到5.0 mM时,经过48 h培养,能完全将亚硒酸钠还原生成SeNPs。透射电镜（TEM）结果表明,纳米硒在胞外和胞内均有分布。通过扫描电镜（SEM）结合能谱（EDX）的分析结果表明,合成的球形纳米颗粒就是纳米硒。动态光散射（DLS）结果显示纳米硒的平均水合直径为178.3±11.5 nm。对不同细胞组分进行体外亚硒酸盐还原活性试验发现,P.mirabilis YC801还原亚硒酸钠的部位为细胞质,而膜蛋白、周质蛋白、上清、胞外多糖均不起作用。同时,反应需要电子供体（NADH/NADPH）参与,所以细胞质中还原亚硒酸盐是一个酶促的过程。实时PCR结果表明,存在于细胞质中的蛋白质如硫氧还蛋白还原酶和延胡索酸还原酶的表达出现上调,而谷胱甘肽相关酶、亚硝酸盐还原酶、亚硫酸盐还原酶不参与亚硒酸钠的还原。此外,也利用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）检测到了纳米硒表面的蛋白质和脂质等有机物。（3）粪产碱菌Alcaligenes faecalis Se03的亚硒酸钠还原特性及产纳米硒机理研究。在好氧培养条件下,该菌株对亚硒酸盐表现出极强的耐受性（可耐受120 mM的亚硒酸钠）。在液体培养条件下,当培养基硒浓度为1.0 mM时,在36 h内能够将亚硒酸钠完全还原;当培养基硒浓度升高到5.0 mM时,经过42 h,能将亚硒酸钠近100%还原形成SeNPs。TEM结果表明,纳米硒在胞外和胞内均有分布。SEM-EDX分析结果表明,该菌株合成的球形纳米颗粒就是纳米硒。DLS结果显示纳米硒的平均水合直径为273.8±16.9 nm。对不同细胞组分进行体外亚硒酸盐还原活性试验发现,A.faecalis Se03对亚硒酸钠的还原在细胞质中完成,而膜蛋白、周质蛋白、上清、胞外多糖均不起作用。同时,反应需要电子供体（NADH/NADPH）参与,所以细胞质部分还原亚硒酸盐是一个酶促的过程。实时PCR结果表明,存在于细胞质中的蛋白质如亚硫酸盐还原酶和硫氧还蛋白还原酶出现表达上调,参与亚硒酸盐还原和SeNPs合成过程。此外,为探究合成的SeNPs表面是否包被有蛋白质等生物大分子,利用FTIR法检测了纳米硒表面存在生物大分子。（4）研究了以A.faecalis Se03合成的纳米硒为基础制成的纳米硒叶面肥,并进一步研究了该叶面肥对番茄产量和品质的影响。田间试验的结果表明,纳米硒肥的处理提高了番茄的硒含量,进一步改善了番茄的营养品质。证明通过微生物合成的纳米硒可以被植物吸收、转化,具有开发成为优良强硒剂的潜质。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 硒的生物学功能
•   1.2 利用微生物合成纳米硒
•     1.2.1 通过细菌合成纳米硒
•     1.2.2 通过酵母合成纳米硒
•     1.2.3 通过真菌合成纳米硒
•   1.3 纳米硒的微生物合成机理
•     1.3.1 硒酸盐的还原
•     1.3.2 亚硒酸盐的还原
•   1.4 生物源纳米硒的应用
•     1.4.1 医药领域
•     1.4.2 生物传感器
•     1.4.3 环境应用
•     1.4.4 功能化农业
•   1.5 纳米硒的毒性
•   1.6 本研究的意义、内容及技术路线
•     1.6.1 研究目的和意义
•     1.6.2 研究内容
•     1.6.3 技术路线
• 第2章 生物合成纳米硒菌株的分离和鉴定
•   2.1 引言
•   2.2 材料
•     2.2.1 实验材料和试剂
•     2.2.2 主要仪器设备
•     2.2.3 溶液配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 松褐天牛的解剖
•     2.3.2 具有纳米硒生物合成活性菌株的筛选
•     2.3.3 具有纳米硒生物合成活性菌株的ARDRA分型
•     2.3.4 高产纳米硒菌株的复筛
•     2.3.5 高产纳米硒菌株的分子生物学鉴定
•     2.3.6 菌株的生理生化鉴定
•     2.3.7 菌种的保藏
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 具有纳米硒生物合成活性菌株的初筛结果
•     2.4.2 初筛菌株的ARDRA分型
•     2.4.3 高产纳米硒菌株的复筛
•     2.4.4 YC801菌株的分子生物学及生理生化鉴定
•     2.4.5 Se03菌株的分子生物学及生理生化鉴定
•   2.5 本章小结
• 第3章 奇异变形杆菌Proteus mirabilis YC801亚硒酸盐还原特性及产硒机理研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料
•     3.2.1 实验试剂
•     3.2.2 主要仪器设备
•     3.2.3 溶液配制
•   3.3 方法
•     3.3.1 菌株的活化及培养条件
•     3.3.2 亚硒酸盐的耐受性测试
•     3.3.3 YC801的还原效率评价
•     3.3.4 SeNPs在细胞中的定位
•     3.3.5 SeNPs分析
•     3.3.6 亚硒酸盐在不同细胞组分中的还原性测定
•     3.3.7 实时荧光定量PCR
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 亚硒酸盐的还原和单质硒的生成
•     3.4.2 硒纳米粒子的定位与表征
•     3.4.3 YC801产SeNPs的特性研究
•     3.4.4 亚硒酸盐在不同细胞组分的还原活性测定
•     3.4.5 实时荧光定量PCR
•   3.5 本章小结
• 第4章 粪产碱菌Alcaligenes faecalis Se03亚硒酸盐还原特性及产硒机理研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料
•     4.2.1 实验材料和试剂
•     4.2.2 主要仪器设备
•     4.2.3 溶液配制
•   4.3 方法
•     4.3.1 菌株的活化及培养条件
•     4.3.2 亚硒酸盐的耐受性测试
•     4.3.3 Se03的还原效率评价
•     4.3.4 SeNPs在细胞中的定位
•     4.3.5 SeNPs分析
•     4.3.6 不同细胞组分的亚硒酸盐还原试验
•     4.3.7 实时荧光定量PCR
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 亚硒酸盐的还原与单质硒的形成
•     4.4.2 A.faecalis Se03中SeNPs的定位分析
•     4.4.3 A.faecalis Se03产SeNPs的特性研究
•     4.4.4 不同细胞组分催化亚硒酸盐还原活性测定
•     4.4.5 实时荧光定量PCR
•   4.5 本章小结
• 第5章 纳米硒叶面肥对番茄产量及品质的影响
•   5.1 引言
•   5.2 材料
•     5.2.1 实验材料
•     5.2.2 主要仪器设备
•     5.2.3 溶液配制
•   5.3 方法
•     5.3.1 纳米硒的制备
• 0的测定'>    5.3.2 Se⁰的测定
•     5.3.3 纳米硒肥的配制
•     5.3.4 田间喷施
•     5.3.5 样品采集及相关数据的测定
•     5.3.6 数据分析
•   5.4 结果与讨论
•   5.5 本章小结
• 第6章 总结与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王钰婷

导师: 吴丽芳

关键词: 生物纳米硒,亚硒酸钠还原,电镜分析,分析,实时

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学技术大学

基金: 国家重点研发计划(2018YFD0300901&2018YFD0502001),国家自然科学基金(31500531),安徽省重大科技专项(16030701103),中科院“十三五”规划重点项目(kp-2017-2),中科院STS项目(KFJ-SW-STS-143-4-2),安徽省自然科学基金(1708085QC70&1808085QC73)

分类号: Q939.9

总页数: 126

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