基于家蚕-杆状病毒表达系统制备重组人蛋白酶3的研究

论文摘要

蛋白酶3（proteinase 3,PR3）是一种中性丝氨酸蛋白酶,主要储存于中性粒细胞的嗜天青颗粒和特定颗粒以及分泌囊泡中,或者转移到质膜上。PR3能够降解细胞外基质蛋白,杀死微生物,还能影响血小板和内皮细胞的活化,调节多种细胞因子、细胞表面受体的生物活性,参与炎症部位的免疫调节反应,是一种参与多种生理活动的多功能蛋白。近年来,大量研究表明,PR3与多种疾病如血管炎性肉芽肿病（granulomatosis with polyangiitis,GPA）、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases,COPD）等的发生发展密切相关。抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）是特异性自身抗体,与各种原发性小血管炎相关,且ANCA的滴度与疾病活动一致。作为ANCA的主要靶抗原之一,PR3及其自身抗体（ANCA）在临床诊断、指导治疗以及疾病病理机制研究等方面具有重要的意义。天然人源PR3蛋白是临床上用于相关疾病诊断的最佳选择,但其来源较少,分离纯化过程复杂,质量不均,成本高昂。因此,严重阻碍了相关疾病体外诊断技术的应用,通过重组技术生产人PR3蛋白是比较好的解决方案。目前,虽然已经在大肠杆菌、酵母和昆虫细胞Sf-9等多种细胞系中成功表达了人PR3,但仍存在许多问题,如操作复杂,产量低,重组蛋白抗原性差,成本较高等等,从而无法用来取代天然人源PR3蛋白。本研究尝试利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中表达重组人PR3。我们设计表达的人PR3蛋白,其C端含6个组氨酸的His-标签,在N端引入昆虫分泌信号肽Mel;将利用PCR扩增得到的Mel-PR3-His片段连接到供体质粒pFastBac1上,获得重组供体质粒pFastBac1-Mel-PR3-His;以重组供体质粒转染大肠杆菌BmDH10Bac,经Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座,蓝白斑筛选后提取出成功转座的重组Bacmid DNA;将重组Bacmid DNA转染家蚕BmN细胞,从而制备得到重组病毒;以重组病毒感染家蚕幼虫,所表达的重组人PR3经昆虫分泌信号肽介导被释放到血淋巴,收集感染后家蚕幼虫的血淋巴;血淋巴上清通过镍柱再结合两种离子交换柱的综合层析方法进行分离纯化,最终获得重组人PR3蛋白,通过单抗杂交和质谱鉴定进行了验证。本研究通过家蚕-杆状病毒表达系统在五龄家蚕幼虫中成功制备了重组人PR3蛋白,该方法不仅成本低,而且表达量高,便于大规模生产,开辟了利用家蚕幼虫作为生物反应器高效生产具有免疫反应活性重组人PR3蛋白的一条可行的新途径,为相关疾病病理研究及诊断等方面提供了一种探索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 蛋白酶3概述
•     1.1.1 蛋白酶3结构
•     1.1.2 蛋白酶3的体内生物合成与分布
•     1.1.3 蛋白酶3生物学功能
•     1.1.4 蛋白酶3与疾病
•     1.1.5 重组蛋白酶3 表达与制备
•   1.2 家蚕-杆状病毒表达系统
•     1.2.1 杆状病毒
•     1.2.2 杆状病毒表达系统
•   1.3 立题依据
•   1.4 研究内容及意义
•     1.4.1 研究路线和研究内容
•     1.4.2 研究意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 载体质粒、细胞、菌种以及家蚕
•     2.1.2 工具酶及试剂盒
•     2.1.3 细胞相关试剂
•     2.1.4 其他试剂和材料
•   2.2 试剂配制
•     2.2.1 分子克隆相关试剂配制
•     2.2.2 细胞培养相关试剂
•     2.2.3 Western Blot相关试剂
•     2.2.4 蛋白纯化相关试剂配制
•   2.3 主要仪器设备
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 PCR反应
•     2.4.2 PCR产物纯化
•     2.4.3 胶回收
•     2.4.4 PR3-His基因与转移载体pMelBacA的双酶切
•     2.4.5 连接反应
•     2.4.6 感受态细胞的制备
•     2.4.7 质粒转移至感受态细胞
•     2.4.8 重组pMelBacA-PR3-His质粒提取
•     2.4.9 重组p MelBacA-PR3-His质粒双酶切验证
•     2.4.10 PCR反应
•     2.4.11 Mel-PR3-His和pFastBac1双酶切
•     2.4.12 连接反应
•     2.4.13 转化
•     2.4.14 重组质粒提取
•     2.4.15 双酶切验证
•     2.4.16 转座
•     2.4.17 重组Bacmid DNA提取
•     2.4.18 PCR反应验证
•     2.4.19 BmN细胞培养
•     2.4.20 病毒制备与扩增
•     2.4.21 重组病毒在五龄家蚕中的表达
•     2.4.22 在五龄家蚕中大量表达人重组PR3的分离纯化
•     2.4.23 SDS-PAGE凝胶电泳
•     2.4.24 Western-Blot免疫印迹反应
•     2.4.25 分离纯化后目的蛋白的质谱鉴定
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 重组家蚕杆状病毒r Bm-pFastBac1-Mel-PR3-His的制备
•     3.1.1 重组转移载体p MelBacA-PR3-His的构建
•     3.1.2 重组供体质粒p FastBac1-Mel-PR3-His的构建
•     3.1.3 重组家蚕杆状病毒的构建
•   3.2 重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His在五龄家蚕中的表达
•   3.3 在五龄家蚕中表达重组人PR3蛋白的分离纯化
•     3.3.1 镍-亲和层析柱纯化人PR3蛋白
•     3.3.2 Mono Q离子交换层析柱纯化
•     3.3.3 Mono S离子交换层析柱纯化
•   3.4 分离纯化后重组人PR3蛋白的鉴定
•     3.4.1 目的蛋白的Western Blot鉴定
•     3.4.2 目的蛋白的质谱鉴定
•   3.5 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间学术研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨玉龙

导师: 周亚竟

关键词: 蛋白酶,家蚕,杆状病毒表达系统,重组蛋白纯化

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江苏大学

分类号: Q78;Q55

总页数: 73

文件大小: 3432K

下载量: 45