摘要：目的 观察神经调节蛋白1（neuregulin 1, NRG1）转染施万细胞（Schwann cells, SCs）条件培养液对骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）增殖及分化的影响。方法 从大鼠骨髓中提取BMSCs，从大鼠坐骨神经中分离纯化SCs，并转染NRG1 基因。收集NRG1-SCs 培养液上清，与完全培养基1:1 混合，制备NRG1-SCs 条件培养液，与第2 代BMSCs 共培养为实验组，相同代次BMSCs 以完全培养液培养为对照组。倒置相差显微镜观察BMSCs 形态变化，MTT 法检测BMSCs 生长情况，ELISA 法检测各组BMSCs 中酪氨酸激酶受体ErbB2 含量，Western blot 检测各组BMSCs 中S-100 蛋白表达。结果 免疫荧光鉴定示BMSCs 呈CD44、CD90 表达阳性，SCs 呈S-100 阳性表达；细胞培养第7d，实验组BMSCs 胞体呈长梭形或多边形，形态类似SCs；细胞生长曲线示，实验组BMSCs 增殖活性高于对照组（P＜0.05）；ELISA 检测示，实验组BMSCs 中ErbB2 含量明显高于对照组（P＜0.05）；Western blot 结果显示，实验组BMSCs 中S-100 蛋白表达水平较对照组显著增高（P＜0.05）。结论 NRG1-SCs 培养液能够促进BMSCs 增殖并诱导其向SCs 分化，其机制可能与NRG1/ErbB 信号通路有关。
关键词：骨髓基质干细胞；施万细胞；神经调节蛋白1；细胞分化
0 引言
周围神经损伤修复和神经残端支配区功能重建是临床中尚未解决的难题[1]。施万细胞（Schwann cells, SCs）是一种存在于外周神经系统的胶质细胞，在周围神经损伤修复过程中发挥着极其重要的作用。当外周神经损伤后，SCs 呈现幼稚化而重新获得分裂增殖的能力，形成Büngner 带，清除轴突溃变碎片，参与形成新的髓鞘[2]。此外，激活态的SCs 还能够释放神经营养因子等多种活性物质，引导轴突延伸。有研究报道，周围神经损伤后，SCs 发生凋亡，造成轴突损伤处SCs 大量丢失。骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）是存在于骨髓中的非造血干细胞，由于来源丰富、容易获得，且可定向分化为神经元、神经胶质等细胞，成为理想的种子细胞[3]。神经调节蛋白1（neuregulin1,NRG1）是神经调节蛋白家族成员之一，在髓鞘生成和周围神经损伤修复过程中具有重要作用。研究证实，NRG1 通过激活其酪氨酸激酶受体ErbBs 发挥神经保护作用[4]。本实验通过观察NRG1过表达SCs 培养液对BMSCs 增殖和分化能力的影响，旨在为临床应用BMSCs 修复外周神经损伤提供理论依据。
1 材料
1.1动物
SPF 级1 月龄SD 大鼠20 只，雌雄各半，由牡丹江医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK（黑）2015-007，昼夜12 h 交替光照，自由食水，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
1.2主要药物和试剂
SCs 培养基（广州赛业生物科技有限公司，中国）、DMEM 培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美国）、FuGen6（Roche 公司，瑞士）、0.125%胰蛋白酶（Sigma 公司，美国）、ErbB2 ELISA Kit（Uscnlife公司，中国）、S-100、CD44、CD90 抗体（Proteintech 公司，美国）、FITC 标记二抗（北京中杉金桥科技公司，中国）。
2 方法
2.1 BMSCs分离及鉴定
大鼠乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，无菌条件下分离股骨和胫骨，并剪除两端骨骺，暴露骨髓腔，用5 mL BMSCs 培养液冲洗骨髓，接种于50 mL 培养瓶中，在37℃、5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养72 h，去除未贴壁细胞。常规培养，每72h 更换培养液一次，当细胞铺满培养瓶底面积80%～90%，用0.25% 胰酶（含0.02%EDTA）消化细胞，按1：2 比例传代培养。取第2 代BMSCs 采用免疫荧光染色鉴定。
2.2 SCs分离及鉴定
10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，无菌条件下将大鼠右侧坐骨神经远端离断，逐层缝合。术后第7 天，切取1cm 预变性坐骨神经，置于4℃的D-hank’s 液中。在体视显微镜下，用显微镊剥除神经外膜，剪成1 mm 小段，加入2.0mL 0.125%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）和1.0 mL 0.08% 胶原酶（Ⅳ型）混合液（2：1，V/V），消化30min 后，加含10%胎牛血清DMEM-H 培养基3.0mL，终止消化。将神经段植于35 mm 培养皿，常规培养，第3 天半量更换SCs 培养液。当SCs 铺满培养皿约80% 时，传代培养，行S-100 免疫荧光鉴定。
2.3 NRG1转染SCs
采用SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行统计学分析，所有数据均以mean ± SD 表示。两组之间比较采用t 检验，P＜0.05 表示有显著性差异。
2.4 NRG1-SCs条件培养液制备及实验分组
在不同时间点，取各组BMSCs 裂解液检测测ErbB2 含量。如图5 所示，从培养第4 天，实验组BMSCs 中ErbB2 含量呈现时间依赖性增加，与对照组相比较，BMSCs 中ErbB2 含量明显增高，以培养第8 天最为显著（P＜0.05）。结果提示，NRG1-SCs 条件培养液能够促进BMSCs 中ErbB2 表达。
2.5 BMSCs增殖检测
倒置相差显微镜下观察可见，对照组BMSCs 生长较缓慢，细胞分散生长，部分细胞聚集在一起，胞体扁平不规则或呈多角形，折光性较差（3A）；实验组BMSCs 呈长梭形，胞体光滑，胞浆透亮，细胞形态趋于一致，细胞排列有一定方向性，呈束状或漩涡状生长，少见扁平不规则细胞（图3B）。
2.6 ErbB2含量检测
细胞培养第0、2、4、6、8、10、12 天，各组随机收集3 个培养瓶中BMSCs，裂解、离心后取上清，按照ELISA 试剂盒说明操作，检测各组BMSCs 中ErbB2 含量。
培养第4 天，有SCs 从组织块边缘爬出，形态细长；培养第10天，可见典型SCs，细胞呈双极或三极；培养第14 天，细胞端端相连呈线状。传代后，SCs 两端伸出纤长突起，相互重叠呈网状排列，免疫荧光染色呈S-100 阳性（图1C）。
2.7 S-100蛋白表达检测
细胞培养第14 天，各组随机选取3 个培养瓶中BMSCs，PBS冲洗3 次，加裂解液于冰上裂解30 min，收集BMSCs，移上清至离心管中，检测蛋白浓度，于-80℃保存备用。
2.8统计学方法
将SCs 种植于90mm 培养皿，常规培养24 h，当细胞生长至培养皿80%，取94 μL DMEM、6 μL FuGen6、3 μL NRG1 质粒混匀，加入SCs 培养皿。培养72 h 后，更换含G-418（800 mg/L）SCs 培养液，培养3 周后，收集G-418 抗性的SCs 培养液，用于后续实验。
3 结果
3.1 BMSCs、SCs培养及鉴定
接种第1 天，大部分BMSCs 呈圆球形，少数细胞聚集在一起。培养3 天后，BMSCs 形态呈不规则形、多角形或有小突起，贴壁生长。培养5～10 天， BMSCs 增殖明显增快，胞体光滑，呈束状或漩涡状生长。当细胞铺满培养瓶底约80%～90% 时，进行传代。免疫荧光染色细胞呈CD44、CD90 表达阳性（图1A-B）。
丽江是云南旅游的名片，中国唯一拥有三项世界遗产桂冠的城市。据了解，2018年暑假，丽江旅游再次火爆，每天20万人涌入丽江古城，超过景区最大游客承载量，惊动了央视新闻直播发布承载预警。大量的游客涌入丽江造成用电负荷持续攀升，丽江供电局采取多项有效措施，全力提升丽江古城供电能力。
细胞培养第12 天，取各组BMSCs 检测S-100 蛋白表达水平。如图6 所示，与对照组相比较，实验组BMSCs 中S-100 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。该结果提示，NRG1-SCs 条件培养液能够促进BMSCs 向SCs 胶质样细胞分化。
图1 BMSCs 和SCs 免疫荧光鉴定（×100）
3.2 NRG1转染SCs
NRG1 转染SCs 后， 细胞增殖速度明显增快，胞体呈长梭形，细胞核大而亮，细胞胞体光滑，细胞浆透亮，荧光显微镜下细胞呈双极或多极梭形（图2）。
图2 NRG1 转染SCs 荧光图（×200）
3.3 BMSCs形态学观察
取生长良好的第2 代BMSCs，制备细胞悬液，以4×103 个/孔接种于96 孔板中。实验组每孔加入100 μL NRG1-SCs 条件培养液，对照组每孔加入100 μL 完全培养液。细胞培养第0、2、4、6、8、10、12 天，每组取6 孔BMSCs，MTT 比色法测定各孔570 nm 波长处吸光度值（A 值）。
图3 BMSCs 光镜图（×200）
A：对照组BMSCs 光镜图；B：实验组BMSCs 光镜图
3.4 BMSCs增殖比较
BMSCs 生长曲线如图4 所示，两组BMSCs 数量均随培养时间延长而增加，BMSCs 接种后第1～2 天为潜伏期，第4～6 天进入对数生长期，第8 天达到最高峰，此后细胞生长缓慢，进入平台期。接种前4 天，两组间A 值比较差异无统计学意义（P＞0.05）；第6～12 天，两组A 值比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。
3.5 ErbB2含量检测
无菌条件收集NRG1-SCs 培养的上清液，并与完全培养基以1：1 比例混合，制备NRG1-SCs 条件培养液，4℃保存备用。实验分为实验组和对照组，实验组加入NRG1-SCs 条件培养液，对照组加入完全培养液培养。倒置相差显微镜下每日观察BMSCs 形态变化。
图4 各组BMSCs 生长曲线比较
注：* P＜0.05 vs. 对照组
图5 各组BMSCs 中ErbB2 含量比较
注：* P＜0.05 vs. 对照组。
3.6 S-100蛋白表达
在中国的传统社会中，养老大多以个人和家庭事务的形式出现。新中国成立后，国有企业的单位福利和民政部门的社会福利有效地支持了家庭养老体系——退休金为大部分城市老年人提供了基本、稳定的收入和医疗保障；养老服务是以行政方式提供剩余性的福利[1]，保障对象为“三无”“五保”人员，为这些没有家庭和收入的老人提供基本生活来源和服务，起着托底保障的作用。除此之外，城市未就业人员和大部分农村老人的养老问题仍旧是由家庭来解决。因而计划经济时代的养老服务实际上是一种完全的国家福利，目标人群狭窄、服务内容单一，保障水平低下。
张仲平哈哈一笑，道：“嘿，这算什么事？怎么啦？你讲课都讲了几十年了，一门选修课怎么会搞得你这么紧张呀?”
图6 各组BMSCs 中S-100 蛋白表达水平比较
4 讨论
周围神经损伤和神经残端支配区功能恢复一直是困扰医学界的难题，至今尚未有效解决。研究表明，外周神经损伤早期，SCs沿受损神经残端向“神经桥”迁移，形成不连续的细胞带，进而引导新生轴突进入“神经桥”，使再生轴突髓鞘化[2]。作为周围神经系统的髓鞘形成细胞，SCs 具有诱导轴突生成、延长，抑制胶质瘫痕形成，促进受损神经组织结修复和支配区域功能恢复。研究表明，外周神经缺损后，SCs 移植能促进轴突再生和神经修复[2]。我们前期研究显示，NRG1-SCs 移植可促进大鼠脊髓损伤后肢体功能的恢复[5]。
本文以江苏省县(区)级政府融资平台为研究对象，在阐述其发展进程的基础上，指出基层融资平台财务风险预防与控制存在的问题，针对存在问题进行简单分析，最后从政府和平台自身两个角度四个方面提出财务风险预防与控制的相应对策。通过对江苏省县(区)级政府融资平台研究发现，政府融资平台的融资职能的剥离和实体化转型已迫在眉睫，必须快速实现实体化转型，才能应对偿债风险，解决融资难的问题。
同学A做企业很早，通过几十年的经营，虽不能说富甲一方，在我们当地也算鼎鼎有名。不过，用现如今的标准衡量，他经营的企业属于污染行业。虽不属于高污染，但也绝对不符合环保要求。近几年，国家对环境保护越来越重视，绿水青山就是金山银山的概念越来越深入人心。于是，每次见到A的时候，便劝他早做打算，转型升级什么的。每次A都不以为然，说他认识某某和某某某，只要肯花钱，每次都能逢凶化吉。甚至别的企业都停产避风头，他的企业依旧机器隆隆。得意之色尽显。
研究发现，BMSCs 具有多向分化潜能，在不同诱导条件下可分化为成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、神经元、神经胶质细胞等细胞，因而BMSCs 成为理想的种子细胞[6-8]。此外，BMSCs 易于获取，不仅克服了细胞来源的局限性，同时也避免了异体组织移植存在的伦理和免疫排斥问题，有效地解决了临床个体化治疗问题。中枢或外周神经系统损伤后，轴突发生脱髓鞘等病理变化，导致肢体功能障碍。因此，有研究者试图通过移植BMSCs 来替代坏死、凋亡的神经元，促进神经功能恢复。然而，BMSCs 移植过程中存在易凋亡、不易存活等问题。NRG1 是神经调节蛋白家族的成员之一，在髓鞘形成和神经再生过程中发挥极其重要作用[9]。当神经损伤时，局部神经组织中NRG1 分泌量严重不足。研究显示，NRG1 基因敲除后，神经髓鞘形成明显障碍[10]。为验证NRG1-SCs 条件培养液对BMSCs 增殖活性以及分化能力的影响，本研究在不同的培养体系中观察了BMSCs 的增殖、分化以及分泌功能。本研究结果证实，NRG1-SCs 条件培养液可诱导BMSCs 向SCs 样细胞分化，且能够增加BMSCs 合成ErbB2 受体蛋白的能力。
总之，NRG1-SCs 条件培养液能够改善BMSCs 的活性，促进BMSCs 向SCs 样细胞分化，其作用机制可能与促进BMSCs 合成ErbB2 受体有关。
思想工作辅导员岗位工作的经历，我受到的最大感悟是学生工作事无巨细，考验的正是我们工作的细致程度和成效，我们要努力成为“学生工作中的一颗细胞君”。众做周知，细胞是构成任何生命体的最基本的元素，它很脆弱，也很顽强，顽强到可以复制，可以感染，可以成长，最终形成有活力的一个一个独立个体，这正是我们在学生工作中要做到的关键点。在学生的思想上、学习上、生活上，细中见成效，细中见成长。
参考文献
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Effect of NRG1-SCs Medium on Proliferation and Differentiation of BMSCs
WU Geng1, WU Yang2, DENG Wei-hong2, BAI Yun-long3, ZHAO Fu-sheng1*, ZHANG Ji-fei1, JIN Xiu-dong1, PAN Xiu-li2
(1 Mudanjiang Medical College, Mudanjiang Heilongjiang； 2 Mudanjiang Medical College Hongqi Hospital, Mudanjiang Heilongjiang； 3 Jiamusi University, Jiamusi Heilongjiang )
ABSTRACT:Objective To observe the effects of neuregulin 1 (NRG1) transfect with Schwann cells (SCs) conditioned medium on the proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs). Methods BMSCs were extracted from rat bone marrow, and SCs were isolated and purified from rat sciatic nerve and transfect with NRG1 gene.The supernatant of NRG1-SCs culture medium was collected and mixed with complete medium to prepare NRG1-SCs conditioned medium (V/V=1:1), which was co-cultured with the second generation BMSCs as the experimental group.The same generation BMSCs were cultured with complete medium as control group. The morphological changes of BMSCs were observed by inverted phase contrast microscope. The growth of BMSCs was detected by MTT assay. The content of ErbB2 in BMSCs was detected by ELISA. The S-100 of BMSCs in each group was detected by Western blot.Results The BMSCs showed positive expression of CD44 and CD90. The SCs showed S-100 positive expression. On the 7th day, the BMSCs in the experimental group were long fusiform or polygonal, and the morphology was similar to SCs.The cell growth curve showed the proliferative activity of BMSCs in the experimental group was higher than that in the control group (P＜0.05). The ELISA assay showed that the content of ErbB2 in the BMSCs of the experimental group was significantly higher than that of the control group (P＜0.05). The results of Western blot showed that the expression level of S-100 in the experimental group was significantly higher than that of the control group (P＜0.05). Conclusion NRG1-SCs culture can promote the proliferation of BMSCs and induce their differentiation into SCs, which may be related to NRG1/ErbB signaling pathway.
KEY WORDS: BMSCs； SCs； Neurogulin1； Differentiation
中图分类号：R329.2
文献标识码：B
DOI:10.19613/j.cnki.1671-3141.2019.86.101
本文引用格式：武庚,武杨,邓卫红,等.NRG1-SCs培养液对骨髓基质干细胞增殖和分化的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(86):177-179.
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（项目编号 12511584）。
作者简介：通讯作者＊：赵富生，男，副教授，牡丹江医学院。
标签：培养液论文; 细胞论文; 实验组论文; 神经论文; 轴突论文; 《世界最新医学信息文摘》2019年第86期论文; 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(项目编号12511584)论文; 牡丹江医学院论文; 牡丹江医学院红旗医院论文; 佳木斯大学论文;