大肠杆菌益生菌Nissle 1917 pic基因缺失株的构建及其相关功能探析

论文摘要

1917年,德国医生Alfred Nissle从志贺菌感染疫区一名未患肠炎士兵粪便中分离得到一株无致病性的大肠杆菌,故将其命名为Nissle 1917（EcN）。EcN能很好地在肠道生存和定植,且不带有主要的毒力因子,具有明显的益生特性,因此其成为除了一些乳酸杆菌外,人类研究最多的益生菌之一。研究表明Nissle 1917其对人类肠道疾病有一定的疗效,以其为主要成分的商品化药物Mutaflor在欧美多个国家被用于炎症性肠病（IBD）的治疗。近年来,Nissle 1917作为靶向呈递外源蛋白的载体,在治疗人类肠道疾病的过程中扮演了越来越重要的角色。在EcN的基因组上,我们比对分析发现了一种编码肠杆菌科丝氨酸蛋白酶（SPATE）的pic基因,基于NCBI上大肠杆菌EcN基因组上注释的pic基因序列,设计一对用于λ-Red同源重组系统试验的pic基因缺失长引物,其5’端与pi基因缺失部分两侧的基因同源,3’端与pKD3质粒上的氯霉素抗性基因cat同源,通过λ-Red同源重组的方式和程序完成pi基因的缺失。首先以pKD3质粒DNA作模板,利用上述缺失引物PCR扩增出两端与pi基因上下游同源,中间部分为cat基因的融合DNA片段。将融合DNA片段与pKD46质粒电转化进入野生型EcN中,在Exo,Beta和Gam三种重组酶的作用下,可以将带有氯霉素抗性的DNA片段置换到Nissle 1917基因组中pic基因的位置。挑取氯霉素抗性平板上的单菌落,设计鉴定引物进行PCR鉴定,筛选出正确的一次重组菌命名为EcNApic::cat。接着向一次重组菌EcNApic:cat中导入具有编码Flp重组酶的pCP20质粒,通过对cat基因两侧Flp位点的识别和重组,去除cat基因从而消除氯霉素抗性。利用PCR鉴定和DNA测序的方法筛选出正确的二次重组菌,命名为EcNApic。在缺失株EcN△pic的基础上,将完整的pic基因连接至表达载体pBR322,并将表达pic基因的重组质粒pBR322-pic导入缺失株EcN△pic中,得到回补菌株EcN△pic/ppic。细菌生长曲线测定结果表明野生株EcN、缺失株EcNApic和回补菌株EcN△pic/ppic的生长特性无明显差异;生物被膜定性和定量试验结果表明,pic基因能显著影响EcN形成生物被膜的能力;仔猪小肠上皮细胞系IPEC-J2体外黏附试验结果显示,pic基因缺失株相较于野生株,黏附能力下降了 41%（p<0.05）;在EcN与人肠道黏附侵袭大肠杆菌AIEC LF82菌株的黏附竞争试验中,LF82与EcN缺失株共孵育时对Caco-2细胞的黏附能力较与EcN野生株共孵育时上升52%（p<0.05）;在EcN与AIEC LF82的侵袭竞争实验中,LF82与野生型EcN共孵育后对Caco-2细胞的侵袭能力较与EcN缺失株共孵育后无明显差异,这可能是由于致病菌的侵袭能力与其自身活力密切相关,而EcN分泌的Pic蛋白只是促进EcN定植肠道细胞,但不会抑制LF82的活性;通过Real Time PCR测定pic基因转录水平与温度的关系,结果显示30℃和42℃时pic基因的转录水平较37℃时分别降低40%和54%（p<0.05）;M1型巨噬细胞MV411（人外周血B细胞白血病细胞）表面受体分子CD14的封闭试验结果显示,相较于Pic蛋白孵育对照组,Pic蛋白孵育CD14封闭组后巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1 β、IL-6、IL-8、IL-10的转录水平分别下降84.4%（p<0.01）、84.7%（p<0.01）、63.0%（p<0.05）、71.6%（p<0.01）和 45.5%（p<0.05）,这可能是由于Pic蛋白作用于巨噬细胞表面受体CD14后,强化了 LPS对细胞的免疫刺激,促进了炎性介质的释放;通过Real-Time PCR测定Caco-2细胞与不同类型EcN孵育后,细胞中几种代表性炎症因子的转录水平,结果显示相较于与野生株共孵育,与pic基因缺失株共孵育后,Caco-2细胞中TNF-α、IL-1p、IL-6、IL-8、IL-10的转录水平分别降低了 69.5%（p<0.01）、79.1%（p<0.01）、77%（p<0.01）、55.0%（p<0.05）和 43.6%（p<0.05）,这可能同样由于EcN分泌的Pic蛋白作用于Caco-2细胞表面CD14所致;利用鼠枸橼酸杆菌诱导小鼠肠炎模型,再向小鼠灌服不同类型的EcN,通过Real-Time PCR测定不同组小鼠肠道代表性炎症因子的转录水平。结果显示,各组小鼠肠道的炎症状况以及炎症因子转录水平无明显差异,这可能是由于在肠道定植的EcN菌量以及其分泌的Pic蛋白和体外实验相比处在较低的水平,Pic蛋白在体内实际发挥的炎症调节能力不显著。本研究初步探究了pic基因在细菌定植和免疫调节方面的作用。体外试验结果表明,EcN分泌的Pic蛋白在一定程度上促进细菌定植肠道细胞,同时提高了宿主细胞的免疫应答水平,但其在动物体内能发挥的实际作用仍需进一步验证。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
•   1. 肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自转运体（SPATE）研究进展
•     1.1 SPATEs及其分布
•     1.2 SPATEs的结构
•     1.3 SPATEs的分泌机制
•     1.4 SPATEs的分类
•     1.5 SPATEs的作用底物与功能
•     1.6 Pic蛋白研究进展
•     1.7 Pic蛋白作用受体CD14介绍
•     1.8 SPATES研究局限及展望
•   2. 大肠杆菌益生菌Nissle 1917研究进展
•     2.1 Nissle 1917的特性
•     2.2 Nissle 1917的临床应用
•   参考文献
• 实验研究
•   研究一 Nissle 1917 pic基因缺失株及回补株的构建
•     1. 材料
•       1.1 菌株和质粒
•       1.2 培养基和主要试剂
•       1.3 主要仪器
•     2. 方法
•       2.1 PCR引物设计
•       2.2 融合PCR产物的扩增和纯化
•       2.3 感受态细胞EcN的制备和质粒pKD46转化
•     2.3.1 感受态细胞EcN的制备
•     2.3.2 质粒pKD46的电转化
•     2.3.3 EcN-pKD46感受态细胞的制备及同源重组酶的诱导
•       2.4 融合PCR产物的电转化
•       2.5 一次重组菌EcN△pic::cat的鉴定
•       2.6 37℃消除温度敏感性质粒pKD46
•       2.7 pCP20中FLP重组酶介导的二次重组
•       2.8 二次重组菌EcN△pic的鉴定
•       2.9 回补菌株EcN△pic ppic的构建
•     3. 结果
•       3.1 融合cat基因的PCR产物鉴定
•       3.2 一次重组菌EcN△pic::cat的鉴定
•       3.3 二次重组菌EcN△pic的鉴定
•       3.4 回补株EcN△pic/ppic的鉴定
•     4. 讨论
•     参考文献
•   研究二 Nissle 1917 pic基因相关功能研究
•     1. 材料
•       1.1 菌株、材料、细胞系
•       1.2 主要试剂
•       1.3 仪器设备
•       1.4 实验动物
•       1.5 统计学分析方法
•     2. 方法
•       2.1 生长曲线测定
•       2.2 IPEC-J2细胞黏附试验
•     2.2.1 IPEC-J2细胞培养、传代及冻存方法
•     2.2.3 IPEC-J2细胞黏附试验方案
•       2.3 Caco-2细胞黏附和侵袭竞争试验
•     2.3.1 Caco-2细胞培养、传代及冻存方法
•     2.3.2 Caco-2细胞的黏附竞争试验
•     2.3.3 Caco-2细胞侵袭抑制试验
•       2.4 生物被膜定性定量试验
•     2.4.1 生物被膜诱导培养基的配置
•     2.4.2 生物被膜定性试验
•     2.4.3 生物被膜定量试验
•       2.5 pic基因转录水平与温度的关系
•     2.5.1 EcN总RNA的提取
•     2.5.2 基因组DNA的去除与总RNA的反转录反应
•     2.5.3 Real-Time PCR反应
•       2.6 巨噬细胞表面CD14封闭试验
•     2.6.1 MV411细胞的的培养和传代
•     2.6.2 CD14封闭试验
•       2.7 pic基因对Caco-2细胞炎症因子转录水平的影响
•     2.7.1 Caco-2细胞的准备
•     2.7.2 EcN接种Caco-2细胞
•     2.7.3 基因组DNA的反转录反应及Real-Time PCR测定炎症因子的转录水平
•       2.8 小鼠肠道炎症调节试验
•     2.8.1 实验动物及饲养环境
• 600值的换算'>    2.8.2 细菌浓度与OD₆₀₀值的换算
•     2.8.3 小鼠肠道炎症调节试验
•     2.8.4 Real-Time PCR测定炎症因子的转录水平
•     3. 结果
•       3.1 细菌生长曲线的测定
•       3.2 IPEC-J2细胞黏附试验
•       3.3 EcN与LF82细胞体外竞争试验
•     3.3.1 Caco-2细胞的黏附竞争试验
•     3.3.2 Caco-2细胞的侵袭竞争试验
•       3.4 生物被膜形成试验
•     3.4.1 生物被膜定性试验
•     3.4.2 生物被膜定量试验
•       3.5 pic基因转录水平与温度的关系
•       3.6 巨噬细胞表面CD14封闭试验
•       3.7 pic基因对Caco-2细胞炎症因子转录水平的影响
•       3.8 小鼠肠道炎症因子调节试验
•     4. 讨论
•     参考文献
• 全文小结
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 梁轩

导师: 朱国强

关键词: 基因,生物被膜,黏附,侵袭,炎症因子

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究(科技部畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发重点专项,2016YFD0500905,2016-2020,牛羊常规细菌病的诊断与检测新技术研究),科技部畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发重点专项(2017YFD0500203),靶向探究K88产肠毒素大肠杆菌毒力相关因子(国家自然科学基金项目,31672579,2017-2020),基于优良益生菌修饰的高新技术开发应用(江苏省重点研发计划(现代农业)BE2017342,2017.7-2020.6),江苏现代农业(奶牛)产业技术体系(疾病防控创新团队)JATS(2018)315,2018.7-2019.6

分类号: S852.61

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000791

总页数: 64

文件大小: 4256K

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