拟南芥REC基因家族功能解析和萝卜根皮花青素控制基因的遗传定位

论文摘要

本课题包括拟南芥REC基因家族功能解析和萝卜根皮花青素控制基因遗传定位两部分。叶绿素和花青素是植物体中常见的色素之一,在植物的生长发育过程中,色素分子扮演了重要的能量传递作用,以维持植物在不同条件下的正常生长,拟南芥REC基因家族与叶绿发育有关1.拟南芥rec突变体的构建与表型分析光合作用是植物吸收太阳能,固定二氧化碳的重要过程,是植物生长发育的基础。宏观层面上,外界环境的变化是影响光合作用效率的主要因素;在细胞学水平上,植物叶肉细胞的叶绿体是光合作用发生的主要场所,细胞内叶绿体的数量和叶绿体的空间大小,决定了叶肉细胞光合作用的效率。拟南芥REC基因家族是迄今发现的唯一一个与叶肉细胞分配给所有叶绿体空间大小机制有关的基因。本研究前期鉴定了一个有严重叶绿素缺乏,叶片几乎白化的psa突变体,其在REC基因家族的三个基因中均有不同于已发表突变体的T-DNA插入。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了新的REC基因家族功能完全丧失的突变体,获得了两种不同的REC1基因敲除后的纯合突变体,REC1、REC3两个基因同时敲除的纯合双突变体和REC2、FRIENDLY两个基因同时敲除的双突变体。我们比较分析了利用CRISPR/Cas9得到的rec1敲除突变体与和已发表的TDNA插入突变体之间叶绿素含量和叶绿体表型后发现:利用CRISPR/Cas9基因编辑获得的rec1突变体叶绿素含量和叶绿体占细胞空间比例更低,但叶绿体的分裂并没有受到影响。此外,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的rec2 friendly双突变体的叶绿素含量较之前发表的rec2 friendly T-DNA突变体中的叶绿素含量更低。这些结果表明:（1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以获得更强的突变体表型（2）REC基因家族不直接影响叶绿体的分裂,但在调控叶绿体占据细胞空间比例中的过程中起着更重要的作用。2.萝卜（Raphanus sativa L.）根皮花青素控制基因遗传定位萝卜根皮花青素的积累可以提高萝卜抵抗生物胁迫和非生物胁迫的能力。前人的研究表明,萝卜根中花青素的积累与花青素合成基因的转录水平差异有关,但是关于萝卜根皮中的花青素积累遗传分子机理还不清楚。本研究构建了两个根表皮有差异的萝卜品种的杂交后代分离群体,根据紫皮萝卜和白皮萝卜的数量统计,分离比例接近3:1,表明该分离群体是单基因分离群体。分别构建20株紫皮萝卜和白皮萝卜的混合池,进行RNAseq测序,通过筛选两个混合池RNA-seq测序结果中具有显著频率差异的SNP,开发分子标记,将控制该性状的基因定位于萝卜7号染色体5.680 MB-6.393 MB之间约670 kb的区域内。参考基因组在该区域内的组装质量很差,分析该区域中开发的标记后,不能进一步缩小候选区域的范围。参考基因组在该区域注释了64个基因,其中含有1个含有MYB结构域的基因和1个正调控花青素代谢的拟南芥bZIP转录因子HY5同源的基因。并且我们在含有MYB结构与的基因编码区检测到17个SNP,其中两个SNP可以引起编码氨基酸由甲硫氨酸转变为缬氨酸;HY5基因的编码区和启动子区域均未检测到碱基差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 拟南芥REC基因家族功能解析
•   1 前言
•     1.1 研究问题的由来
•     1.2 文献综述
•       1.2.1 质体的起源与分类
•       1.2.2 叶绿体和色素的合成
•       1.2.3 叶绿体分裂机制
•       1.2.4 叶绿体占细胞空间大小的调控机制
•       1.2.5 植物基因编辑系统
•     1.3 研究目的和意义
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 植物材料
•       2.1.2 菌株和载体
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 拟南芥材料的种植
•       2.2.2 拟南芥杂交
•       2.2.3 T-DNA插入突变体的鉴定
•       2.2.4 植物样品的DNA提取
•       2.2.5 CRISPR/Cas9 敲除载体的构建
•       2.2.6 拟南芥遗传转化
•       2.2.7 阳性苗的筛选与检测
•       2.2.8 TA克隆
•       2.2.9 叶绿素提取与测量
•       2.2.10 叶肉细胞叶绿体表型的鉴定
•   3 结果与分析
•     3.1 psa突变体的遗传鉴定
•       3.1.1 psa表型的遗传分析
•       3.1.2 F1 单株不同T-DNA位置的鉴定
•     3.2 基于超表达启动子的敲除载体构建与遗传转化结果分析
•       3.2.1 敲除载体的构建
•       3.2.2 REC1 基因敲除突变体的构建
•     3.3 基于生殖细胞特异表达基因DD45 启动子的CRISPR/Cas9 载体构建与敲除突变体表型分析
•       3.3.1 敲除载体的构建与遗传转化结果分析
•       3.3.2 目标基因编辑检测
•     3.4 不同rec1 突变体叶绿素含量和叶肉细胞叶绿体表型分析
•       3.4.1 叶绿素含量分析
•       3.4.2 叶绿体表型分析
•   4 讨论
•     4.1 部分rec突变体功能的研究
•     4.2 REC基因家族的后续研究
• 第二章 萝卜根皮花青素控制基因的遗传定位
•   1 前言
•     1.1 研究问题的由来
•     1.2 文献综述
•       1.2.1 花青素合成与转运
•       1.2.2 花青素的合成调控
•       1.2.3 十字花科花青素代谢研究简介
•       1.2.4 图位克隆
•       1.2.5 萝卜基因组概况
•     1.3 研究目的和意义
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 实验方法:
•       2.2.1 混合池样品RNA提取
•       2.2.2 RNA测序与数据分析
•       2.2.3 差异表达分析
•       2.2.4 GO和通路分析
•       2.2.5 DNA分子标记的开发
•   3 结果与分析
•     3.1 控制萝卜紫皮单基因分离群体鉴定
•     3.2 测序混合池构建及BSR RNA-seq数据分析
•     3.3 萝卜根皮花青素控制基因的初定位
•     3.4 差异表达基因分析
•     3.5 差异表达基因GO富集分析
•   4 讨论
•     4.1 萝卜紫皮花青素合成调控
•     4.2 萝卜根皮花青素后续研究
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈泽凡

导师: 匡汉晖,BOBERT M.LARKIN

关键词: 拟南芥,叶绿体,基因家族,图位克隆,萝卜,花青素

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 华中农业大学

分类号: Q943.2;S631.1

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000777

总页数: 75

文件大小: 16923K

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