原始生殖细胞特异性相关基因内源性激活的研究

论文摘要

原始生殖细胞是生殖细胞的祖细胞,它具有分化为精子细胞和卵细胞的能力。通过将体细胞重编程技术与体外诱导分化技术结合获得原始生殖细胞已成为不孕不育临床治疗的重要研究策略。近年发现CRISPR/Cas9技术不仅可以用于基因敲除,同样可以起到基因转录激活的作用。本研究利用CRISPR-Cas9介导的靶向基因激活,从sgRNA靶向基因的不同区域、sgRNA组合以及不同的激活系统三方面进行比较,开展针对原始生殖细胞特异性相关基因内源性激活的研究。具体研究结果如下:（1）利用转录激活系统Cas9-p300,针对生殖细胞特异性相关基因进行内源性激活。通过对目的基因Blimp1,Tfap2c,Dazl,Sox17,Nanos2,Pax5,Boll,Ddx4的启动子区域设计sgRNA,在293T细胞内共转染Cas9-p300系统的载体与携带sgRNA的载体检测目的基因的表达。结果显示,利用Cas9-p300系统可以激活生殖细胞特异性基因的表达,但基因之间的激活效率有差异;同时利用多个sgRNA对一个基因进行激活,结果表明,利用多个sgRNA对目的基因激活效率比单个sgRNA要高;为进一步探究是否存在可以激活靶基因的其他潜在位点,通过在基因Nanos2,Ddx4潜在的增强子区域设计sgRNA对目的基因进行激活,结果表明,靶定潜在增强子区域未呈现出明显的激活效率。（2）利用2种不同的“二代”转录激活系统Cas9-p300系统和CRISPR/dCas9-VPR系统对Blimp1,Tfap2c,Nanos2等生殖细胞特异性相关基因进行激活并比较2个转录激活系统的激活效率。结果表明,Cas9-p300系统在激活Blimp1基因中有更高的激活效率,而dCas9-VPR系统在激活Nanos2,Dazl,Sox17基因中有更高的激活效率;2个系统在激活Tfap2c,Ddx4基因中有相近的激活效率,但两个系统均无法有效激活Ddx4基因;免疫荧光染色结果显示在蛋白水平上CRISPR/dCas9-VPR系统可以检测到Tfap2c基因的表达。上述结果表明Cas9-p300和CRISPR/dCas9-VPR 2个系统均可用于转录激活调控,且在对不同的基因进行激活时呈现出不同激活趋势。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
•   1.1 原始生殖细胞及其体外分化
•     1.1.1 原始生殖细胞
•     1.1.2 原始生殖细胞体外分化的研究进展
•   1.2 CRISPR-Cas9 技术
•     1.2.1 CRISPR-Cas9 系统的作用机制
•     1.2.2 CRISPR-Cas9 技术的应用
•     1.2.3 CRISPRa系统的发展
•     1.2.4 CRISPRa系统的应用
•   1.3 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞
•     2.1.2 载体
•     2.1.3 试剂
•     2.1.4 细胞培养液
•     2.1.5 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.1.1 启动子区域sgRNA的设计
•     2.1.2 PEI转染293T细胞
•     2.1.3 荧光定量PCR检测目的基因表达量
•     2.1.4 增强子区域 sgRNA 的设计
•     2.1.5 免疫荧光染色检测目的基因的蛋白表达
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 重组转录激活系统相关载体
•   3.2 宿主细胞转录激活系统高效表达
•   3.3 靶向启动子区域的基因激活
•   3.4 多个sgRNA组合进行转录激活
•   3.5 靶向增强子区域的基因激活
•   3.6 两个转录激活系统的效率比较
• 第四章 总结与讨论
• 参考文献
• 附录1
• 硕士学习期间撰写、发表的主要论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 卢佳豪

导师: 肖亚梅,赵小阳

关键词: 内源性激活,细胞,生殖发育相关基因

来源: 湖南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物学,基础医学

单位: 湖南师范大学

分类号: Q343;R321.1

总页数: 54

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