拟南芥钙调蛋白CBP60g在大肠杆菌和昆虫细胞内的表达与纯化

拟南芥钙调蛋白CBP60g在大肠杆菌和昆虫细胞内的表达与纯化

论文摘要

植物通过调节胞内钙离子浓度对外界不良环境因素进行防御。钙调素(CaM)是一类最主要的钙离子感受器,钙离子-钙调素(Ca2+-CaM)复合体与钙调素结合蛋白(CBPs)结合构象发生变化后参与植物对生物和非生物胁迫的响应。CBP60g蛋白作为CBPs蛋白家族中的重要一员,在抗病、抗旱、正向调节ABA和SA介导的信号途径以及负调控花青素的合成过程中起着非常重要的作用。本研究尝试了在大肠杆菌和昆虫细胞内进行可溶性表达和纯化拟南芥CBP60g蛋白,期望为今后解析其三维结构提供依据。具体结果如下:1.对CBP60g的氨基酸序列进行分析和预测表明,其含有11个糖基化位点、76个磷酸化位点、没有跨膜结构域。2.以野生拟南芥cDNA为模板,利用PCR扩增技术得到拟南芥CBP60g故基因,其cDNA 全长为 1689 bp。3.利用TEV-LIC技术分别构建大肠杆菌表达载体,并转化到表达菌株BL21(DE3)。经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE检测发现,目的蛋白CBP60g主要以包涵体的形式存在。4.成功构建杆状病毒转移载体,转化到E.coli DH1OBac后得到重组杆状病毒质粒,转染到昆虫细胞中进行表达蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白大小约为75 KDa,比预测蛋白大小(62 KDa)略大。经过阴离子交换纯化后,根据所建立的蛋白标准曲线计算蛋白浓度为996.5 ng/mL,经过Western Blotting验证,所纯化的蛋白质为CBP60g。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 1 引言
  •   1.1 植物钙信号
  •     1.1.1 钙离子
  •     1.1.2 钙离子感受器
  •     1.1.3 钙信号的转导
  •   1.2 钙调素蛋白概述
  •     1.2.1 钙调素
  •     1.2.2 钙调素结合蛋白
  •     1.2.3 CBP60g
  •   1.3 重组蛋白表达系统
  •     1.3.1 大肠杆菌表达系统
  •     1.3.2 昆虫细胞-杆状病毒表达体系
  •     1.3.3 昆虫细胞杆状病毒表达系统与大肠杆菌表达系统的比较
  •   1.4 研究的目的与意义
  •   1.5 实验技术路线
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料与仪器
  •     2.1.1 菌株、质粒与引物
  •     2.1.2 试剂、工具酶及耗材
  •     2.1.3 仪器及设备
  •     2.1.4 溶液与配制方法
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 拟南芥总RNA以及cDNA的获取
  •     2.2.2 目的基因的获得
  •     2.2.3 构建大肠杆菌表达载体
  •     2.2.4 大肠杆菌表达目的蛋白
  •     2.2.5 Ni-NTA纯化目的蛋白
  •     2.2.6 目的蛋白的鉴定
  •     2.2.7 构建昆虫细胞表达载体
  •     2.2.8 构建重组杆状病毒质粒
  •     2.2.9 昆虫细胞表达重组病毒
  •     2.2.10 昆虫细胞表达目的蛋白
  • 3 结果与分析
  •   3.1 拟南芥CBP60g蛋白的性质
  •     3.1.1 目的蛋白CBP60g疏水性N端的预测
  •     3.1.2 CBP60g蛋白的二级结构预测
  •     3.1.3 CBP60g蛋白糖基化位点预测
  •     3.1.4 CBP60g蛋白磷酸化位点预测
  •   3.2 利用大肠杆菌表达系统表达拟南芥CBP60g
  •     3.2.1 拟南芥RNA的提取与cDNA的合成
  •     3.2.2 目的基因CBP60g的获得
  •     3.2.3 构建大肠杆菌表达载体
  •     3.2.4 大肠杆菌重组质粒鉴定
  •     3.2.5 目的蛋白CBP60g在大肠杆菌中的诱导表达、纯化
  •   3.3 利用昆虫细胞表达系统表达拟南芥CBP60g
  •     3.3.1 构建杆状病毒转移载体
  •     3.3.2 重组质粒双酶切鉴定
  •     3.3.3 重组菌测序结果
  •     3.3.4 构建重组杆状病毒质粒
  •     3.3.5 重组杆状病毒质粒的鉴定
  •     3.3.6 CBP60g蛋白在昆虫细胞中的表达、纯化与鉴定
  • 4 讨论
  •   4.1 拟南芥CBP60g蛋白在大肠杆菌中的表达分析
  •   4.2 拟南芥CBP60g蛋白在昆虫细胞中的表达分析
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者简介
  • 附录
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 于爽

    导师: 丛靖宇

    关键词: 拟南芥,表达纯化,大肠杆菌表达系统,昆虫细胞表达系统

    来源: 内蒙古农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 内蒙古农业大学

    基金: 国家自然科学基金项目“AtMYB2在拟南芥与丁香假单胞菌互作中的作用及其与CBP60g的关系(31360056),呼和浩特市科技计划项目重大专项:“北方高寒干旱半干旱地区沟壑边坡植被修复技术研究”2017-社-重-4,内蒙古自治区产业创新创业人才团队,内蒙古自治区科技创新团队建设计划项目“内蒙古自治区抗逆植物遗传资源利用与分子改良科技创新团队(201503004)”

    分类号: Q78

    总页数: 64

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    • [1].拟南芥钙调素结合蛋白基因启动子的克隆及表达[J]. 西北植物学报 2012(01)

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