亮氨酸调节mTORC1及脂肪酸β氧化的机理研究

论文摘要

亮氨酸除了能作为蛋白质合成的底物外,还能参与多种生物学通路的调控,但亮氨酸对细胞内整体蛋白质组影响的研究还鲜有报道。同时,亮氨酸被发现能调控mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）信号通路,但其中的机制还未被完全阐明。为了解决以上两个问题,本论文主要开展3方面的研究:首先我们对课题组前期无细胞体系结合蛋白质组学技术鉴定到的可能参与调控亮氨酸刺激的mTORC1信号通路的蛋白进行了验证及研究。接着我们利用比较蛋白质组学技术同位素标记相对与绝对定量（iTRAQ）技术分析了亮氨酸缺失及重补后细胞内整体蛋白质组的变化,通过分析及验证发现亮氨酸缺失能激活肝细胞内脂肪酸β氧化通路。最后研究了亮氨酸缺失激活脂肪酸β氧化的可能机理。主要研究成果如下:1.KAT7介导的CANX的巴豆酰化参与调控亮氨酸刺激的mTORC1活性本研究首先通过对前期结果的分析确定了可能参与调控亮氨酸激活的mTORC1的关键调控蛋白Calnexin（CANX）。通过western blot及免疫荧光分析发现亮氨酸缺失能促进CANX移位至溶酶体。进一步的功能试验发现CANX敲除的细胞中mTORC1活性对亮氨酸缺失不敏感,且mTORC1的溶酶体移位也对亮氨酸缺失不敏感,而对血清饥饿仍旧敏感,证明CANX在亮氨酸（而不是生长因子）调控mTORC1活性中是必需的,且更有可能参与调控mTORC1的溶酶体移位;通过构建RAGA/RAGB双敲及CANX/RAGA/RAGB三敲的细胞系,我们发现CANX在RAG GTPase的上游调控mTORC1活性。进一步的免疫沉淀（IP）结合质谱分析及后续的验证试验发现亮氨酸缺失后CANX会移位至溶酶体表面与溶酶体表面标记蛋白LAMP2（Lysosome-associated membrane glycoprotein 2）结合,而LAMP2敲除细胞中CANX不能在亮氨酸缺失后移位至溶酶体表面,并且mTORC1的溶酶体移位和活性对亮氨酸缺失不敏感。通过继续探讨亮氨酸缺失诱导CANX移位至溶酶体表面的机制,我们发现亮氨酸缺失能提高CANX K525位点的巴豆酰化修饰,而CANX K525位点的巴豆酰化修饰对亮氨酸调控的mTORC1是必需的。最后我们综合运用IP、免疫荧光及体外巴豆酰化试验证明了乙酰化酶KAT7（lysine acetyltransferase 7）介导了亮氨酸缺失诱导的CANX K525位点的巴豆酰化。上述结果为新型蛋白质翻译后修饰,如巴豆酰化,调控mTORC1信号通路的机理提供了新的资料。2.亮氨酸缺失激活细胞内脂肪酸β氧化通路为了研究亮氨酸对肝细胞蛋白质组的影响,我们首先利用比较蛋白质组学技术iTRAQ分析了亮氨酸缺失后肝细胞内整体蛋白质组的变化。蛋白质组学一共定量到3066个蛋白,其中有189个蛋白在亮氨酸缺失后差异表达,178个蛋白在亮氨酸重补后差异表达。进一步的生物信息学分析发现亮氨酸的缺失或重补影响了肝细胞内多条信号通路及代谢过程,包括氨基酸代谢。经典代谢通路分析发现亮氨酸缺失后脂肪酸β氧化通路可能受到影响,而参与脂肪酸β氧化通路的3个关键酶ACADS（Short-chain specific acyl-CoA dehydrogenase）、ACOX1（Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1）和ACSL1（Long-chain acyl-CoA synthetase 1）均在亮氨酸缺失后丰度上调。进一步的蛋白免疫印迹检测证实了这一现象。随后我们利用油红O染色及三酰甘油的直接测定发现亮氨酸缺失能够减少肝细胞内脂质的含量,说明亮氨酸缺失可能通过激活脂肪酸β氧化通路而加快脂质分解的速度以调节肝细胞内脂质代谢稳态。本研究首次对亮氨酸处理后的细胞的整体蛋白质组变化进行了分析,并发现亮氨酸缺失能够激活肝细胞内的脂肪酸β氧化通路。3.mTORC1依赖的自噬在PPARγ上游调控亮氨酸缺失激活的脂肪酸β氧化通路本研究在前一章发现亮氨酸缺失激活肝细胞内脂肪酸β氧化通路的基础上,致力于探讨其中可能的机理。我们首先发现亮氨酸缺失在小鼠原代肝细胞系AML12细胞中也能通过升高Acads、Acox1和Acsl1的丰度而激活脂肪酸β氧化通路,降低细胞内游离脂肪酸（FFA）含量,减少细胞内三酰甘油（TG）的积累,同时升高细胞内ATP的含量。Q-PCR试验发现Acads、Acox1和Acsl1的mRNA丰度在亮氨酸缺失后显著上升,提示亮氨酸缺失可能通过转录调控方式上调脂肪酸β氧化相关蛋白的表达。通过生物信息学的上游预测分析,我们发现转录因子PPARγ可能参与调控这3个基因的转录表达。PPARγ的抑制剂GW9662处理显著降低了Acads、Acox1、Acsl1蛋白质及mRNA丰度、增加了细胞内FFA和TG含量,减少了ATP的含量。且这3个蛋白的蛋白及mRNA丰度对亮氨酸缺失变得不敏感,说明PPARγ参与调控亮氨酸调节的脂肪酸β氧化通路。进一步的研究发现mTORC1的抑制剂雷帕霉素以及ATG5敲除的自噬缺陷细胞内,脂肪酸β氧化相关的3个蛋白的丰度对亮氨酸缺失均不敏感,自噬的抑制剂3-MA处理也得到了类似的结果,说明mTORC1依赖的自噬的活性也参与调控亮氨酸缺失激活的脂肪酸β氧化通路。最后通过对细胞同时进行GW9662及雷帕霉素处理,我们发现GW9662处理不会影响mTORC1和自噬的活性,而雷帕霉素和GW9662同时处理与GW9662单独处理细胞内Acads、Acox1、Acsl1蛋白质及mRNA丰度规律变化一致,说明mTORC1及自噬过程在PPARγ的上游调控亮氨酸刺激的脂肪酸β氧化通路。本研究为阐明亮氨酸调控脂肪酸β氧化通路的机理及研究亮氨酸调控的自噬过程的生物学功能提供了新的资料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
•   1 mTORC1 信号通路的上游调控及下游生物学事件
•     1.1 mTORC1 简介
•     1.2 mTORC1 活性的调控
•       1.2.1 mTORC1 的调控蛋白
•       1.2.2 mTORC1 的翻译后修饰调控研究进展
•     1.2.2.1 磷酸化
•     1.2.2.2 乙酰化
•     1.2.2.3 泛素化
•     1.2.2.4 氨基酰化
•     1.2.2.5 SUMO化
•     1.3 mTORC1 调控的生物学事件
•       1.3.1 蛋白质合成与降解
•       1.3.2 糖类和脂质代谢
•       1.3.3 细胞器稳态
•       1.3.4 癌症与衰老
•   2 亮氨酸功能的研究进展
•     2.1 亮氨酸简介
•     2.2 亮氨酸功能
•   3 比较蛋白质组学技术及在氨基酸功能研究中的应用
•     3.1 常用的比较蛋白质组学技术
•     3.2 蛋白质组学技术研究在氨基酸功能研究中的应用
•   4 本研究的目的与意义
• 第二章 亮氨酸调控mTORC1 信号通路的机理研究
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 试验材料
•       2.1.1 细胞
•       2.1.2 载体与质粒
•       2.1.3 主要药品与试剂
•       2.1.4 主要培养基及配制
•       2.1.5 缓冲液
•     2.2 试验方法
•       2.2.1 细胞传代、冻存与复苏
•     2.2.1.1 HEK293T细胞的传代
•     2.2.1.2 HEK293T细胞的冻存
•     2.2.1.3 HEK293T细胞的复苏
•       2.2.2 细胞处理
•       2.2.3 细胞总RNA的提取
•       2.2.4 反转录PCR
•       2.2.5 基因敲除细胞系的构建
•       2.2.6 载体的构建与转染
•     2.2.6.1 PCR扩增cds序列
•     2.2.6.2 DNA凝胶电泳及目的条带回收
•     2.2.6.3 酶切质粒
•     2.2.6.4 酶切质粒的回收
•     2.2.6.5 重组反应
•     2.2.6.6 质粒的转化
•     2.2.6.7 重组产物的鉴定
•     2.2.6.8 无内毒素质粒的提取
•     2.2.6.9 质粒转染
•       2.2.7 CANX点突变
•       2.2.8 免疫共沉淀
•       2.2.9 IP产物质谱分析
•       2.2.10 蛋白纯化
•       2.2.11 体外巴豆酰化试验
•       2.2.12 Western blot
•     2.2.12.1 细胞总蛋白质的提取
•     2.2.12.2 SDS-PAGE
•     2.2.12.3 凝胶电泳、转膜及显影
•       2.2.13 免疫荧光试验
•       2.2.14 数据分析
•   3 结果与分析
•     3.1 亮氨酸缺失促进CANX移位至溶酶体
•     3.2 CANX参与调控亮氨酸刺激的mTORC1 活性
•     3.3 CANX在 Rag GTPases的上游调控mTORC1 活性
•     3.4 LAMP2 在亮氨酸缺失条件下与CANX结合并调控CANX的溶酶体移位
•     3.5 CANX的K525 位点的巴豆酰化修饰对亮氨酸刺激的mTORC1 活性必需
•     3.6 KAT7 介导亮氨酸缺失诱导的CANX K525 位点的巴豆酰化
•   4 讨论
•   5 小结
• 第三章 亮氨酸缺失对肝细胞整体蛋白质组影响的研究
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 试验材料
•       2.1.1 细胞
•       2.1.2 主要药品与试剂
•       2.1.3 主要培养基及配制
•       2.1.4 缓冲液
•     2.2 试验方法
•       2.2.1 HepG2 细胞的传代、冻存与复苏
•       2.2.2 HepG2 细胞的处理
•       2.2.3 蛋白质样品的制备、蛋白的消化及iTRAQ试剂的标记
•       2.2.4 强离子交换层析
•       2.2.5 依赖于Q EXACTIVE的 LC-ESI-MS/MS
•       2.2.6 生物信息学分析
•       2.2.7 Western Blot
•       2.2.8 油红O染色
•       2.2.9 细胞内三酰甘油的测定
•       2.2.10 统计学方法
•   3 结果与分析
•     3.1 亮氨酸缺失及补加后HepG2 细胞差异表达蛋白质的鉴定
•       3.1.1 iTRAQ样品的预处理
•       3.1.2 差异表达蛋白质的鉴定
•       3.1.3 差异表达蛋白质的验证
•     3.2 差异表达蛋白质的生物信息学分析
•       3.2.1 差异表达蛋白质的亚细胞定位
•       3.2.2 差异表达蛋白质的功能分类
•       3.2.3 差异表达蛋白的互作网络分析
•     3.3 亮氨酸的缺失及重补对HepG2 细胞氨基酸代谢相关蛋白质的影响
•     3.4 亮氨酸的缺失及重补对HepG2 细胞脂肪酸代谢通路的影响
•       3.4.1 差异表达蛋白质参与的经典通路分析
•       3.4.2 脂肪酸β氧化通路的验证
•       3.4.3 亮氨酸对HepG2 细胞脂质积累的影响
•   4 讨论
•   5 小结
• 第四章 亮氨酸缺失通过自噬及PPARγ激活脂肪酸β氧化的机理研究
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 试验材料
•       2.1.1 细胞
•       2.1.2 主要药品与试剂
•     2.2 试验方法
•       2.2.1 细胞的培养、传代、冻存与复苏
•       2.2.2 细胞总RNA的提取
•       2.2.3 反转录PCR
•       2.2.4 实时荧光定量PCR
•       2.2.5 细胞核质分离
•       2.2.6 透射电镜
•       2.2.7 Western blot
•       2.2.8 甘油三酯、游离脂肪酸的测定
•       2.2.9 ATP含量的测定
•       2.2.10 油红O染色
•   3 结果与分析
•     3.1 亮氨酸缺失激活正常肝细胞内的脂肪酸β氧化通路
•     3.2 PPARγ转录调控亮氨酸缺失激活的脂肪酸β氧化
•     3.3 mTORC1 依赖的自噬在PPARγ上游调控亮氨酸缺失激活的脂肪酸β氧化过程
•   4 讨论
•   5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 在读期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 严国楷

导师: 晏向华

关键词: 亮氨酸,巴豆酰化,脂肪酸氧化,脂质代谢,自噬

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华中农业大学

分类号: Q493

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000024

总页数: 141

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