产木聚糖酶嗜热真菌鉴定基因克隆及米曲霉表达系统构建

论文摘要

木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系,在食品、饲料领域应用广泛。但目前该酶的应用受到酶活低、热稳定性差、不安全等因素的制约。本文通过将食品级米曲霉系统和产木聚糖酶嗜热菌株有机结合起来,为木聚糖酶基因工程方法获得酶活高、工业成本低、安全的木聚糖酶研究提供新的思路奠定基础。主要实验结果如下:（1）对实验室前期保存的一株产木聚糖酶真菌TL01进行形态学、18S rDNA及产酶鉴定,其结果表明TL01为梳棉状嗜热真菌,测得粗酶活为0.250?0.03 U/mL;对其两种主要的木聚糖酶基因（xyn11A和xyl43）进行克隆和分子生物学分析。xyn11A预测蛋白分子量24.36 kDa,等电点为4.77,含有19个氨基酸的信号肽序列,属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,其二级结构主要是无规则卷曲（44.89%）;xyl43蛋白分子量38.24kDa,等电点为5.23,编码的胞内蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,无规则卷曲（59.76%）是其主要的二级结构。（2）通过紫外诱变技术并结合表型、测序验证得到一株pyrG营养缺陷型菌株RIB40△pyrG。将pyrG筛选标记、启动子及信号肽amyB、终止子amyBt、组氨酸标签及报告基因GFP连入质粒pBC-Hygro中,构建表达载体pBC-Hygro.4。将载体通过PEG法转入米曲霉RIB40△pyrG,使用荧光显微镜观察可看到发出荧光的菌丝体,证明载体构建成功。（3）构建木聚糖酶-米曲霉表达载体pBC-Hygro-xyn11A和pBC-Hygro-xyl43并转入米曲霉RIB40△pyrG。通过菌落PCR鉴定成功筛选到两种木聚糖酶-米曲霉表达宿主菌。这也是首次构建木聚糖酶-米曲霉表达系统,为后续进一步进行木聚糖酶高效表达研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.耐高温真菌研究概况
•   2.木聚糖降解酶的研究进展
•     2.1 木聚糖降解酶分类
•     2.2 木聚糖酶的应用
•     2.3 木聚糖酶的生产
•   3.米曲霉转化系统的研究进展
•     3.1 米曲霉基因组
•     3.2 选择性标记的应用
•     3.3 转化方法
•     3.4 染色体加工技术的开发及应用
•     3.5 米曲霉表达异源蛋白
•   4.主要研究内容及意义
•     4.1 主要研究内容
•     4.2 研究意义
•     4.3 技术路线
• 第二章 产木聚糖酶真菌的鉴定
•   1.引言
•   2.材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 实验菌株
•       2.1.2 主要试剂及药品
•       2.1.3 主要溶液
•       2.1.4 培养基
•       2.1.5 主要仪器与设备
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 菌株活化
•       2.2.2 形态学鉴定
•       2.2.3 分子生物学鉴定
•       2.2.4 产木聚糖酶鉴定
•   3.实验结果与分析
•     3.1 形态学鉴定
•     3.2 分子生物学鉴定
•     3.3 产木聚糖酶鉴定
•   4.讨论
• 第三章 木聚糖酶基因克隆及生物信息学分析
•   1.引言
•   2.材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 实验菌株
•       2.1.2 主要试剂及药品
•       2.1.3 主要溶液
•       2.1.4 培养基
•       2.1.5 主要仪器与设备
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 菌株TL01RNA的提取
•       2.2.2 RNA反转录
•       2.2.3 木聚糖酶基因克隆
•       2.2.4 菌株TL01 木聚糖酶基因序列分析
•   3.实验结果与分析
•     3.1 菌株TL01 木聚糖降解酶基因的克隆
•     3.2 构建克隆载体
•     3.3 菌株TL01 两种木聚糖酶生物信息学分析
•   4.讨论
• 第四章 米曲霉pyrG缺陷菌株的构建
•   1.引言
•   2.材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 实验菌株
•       2.1.2 主要试剂及药品
•       2.1.3 主要溶液
•       2.1.4 培养基
•       2.1.5 主要仪器与设备
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 米曲霉RIB40 菌株的活化
•       2.2.2 菌体培养
•       2.2.35 -FOA最小浓度的确定
•       2.2.4 紫外诱变筛选米曲霉RIB40 pyrG营养缺陷型菌株
•       2.2.5 米曲霉RIB40 pyrG营养缺陷型菌株传代稳定性
•       2.2.6 米曲霉RIB40 pyrG营养缺陷型菌株的验证
•   3.实验结果与分析
•     3.1 5-FOA最小浓度的确定
•     3.2 米曲霉RIB40 pyrG缺陷株的验证
•       3.2.1 表型验证
•       3.2.2 基因组验证
•   4.讨论
• 第五章 米曲霉表达载体的构建
•   1.引言
•   2.材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 实验菌株
•       2.1.2 主要试剂及药品
•       2.1.3 主要溶液
•       2.1.4 培养基
•       2.1.5 主要仪器与设备
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 米曲霉RIB40 潮霉素抗性的验证
•       2.2.2 潮霉素抗性的破坏
•       2.2.3 米曲霉表达载体pyrG抗性构建
•       2.2.4 终止子amyBt序列
•       2.2.5 启动子及信号肽序列（amyB）
•       2.2.6 米曲霉可亲和纯化通用表达载体的构建
•       2.2.7 米曲霉原生质体制备
•       2.2.8 报告基因GFP的表达
•   3.实验结果与分析
•     3.1 潮霉素抗性的验证
•     3.2 潮霉素抗性的破坏
•     3.3 表达载体pyrG抗性构建
•     3.4 表达载体终止子序列构建
•     3.5 表达载体启动子及信号肽序列构建
•     3.6 可亲和纯化通用表达载体的构建
•     3.7 米曲霉表达载体的验证
•   4.讨论
• 第六章 木聚糖酶基因在米曲霉中的表达构建研究
•   1.引言
•   2.材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 实验菌株
•       2.1.2 主要试剂及药品
•       2.1.3 主要溶液
•       2.1.4 培养基
•       2.1.5 主要仪器与设备
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 木聚糖酶基因的扩增
•       2.2.2 木聚糖酶基因序列胶回收
•       2.2.3 组氨酸标签克隆
•       2.2.4 木聚糖酶-米曲霉表达载体构建
•       2.2.5 米曲霉原生质体制备
•       2.2.6 木聚糖酶的表达
•   3.实验结果与分析
•     3.1 获得片段xyn11A+His-Tag和 xyl43+His-Tag
•     3.2 木聚糖酶-米曲霉表达载体构建
•     3.3 转米曲霉及阳性转化子筛选
•   4.讨论
• 第七章 总结及展望
•   1.论文总结
•   2.创新点
•   3.不足与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 金伟琼

导师: 唐自钟

关键词: 木聚糖酶,鉴定,缺陷株,米曲霉表达载体,构建

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 四川农业大学

分类号: Q55;Q78

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000371

总页数: 100

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