娜木日乌日娜（鄂尔多斯市蒙医研究所017000）
【中图分类号】R289【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）26-0127-04
【摘要】本文主要阐述了中蒙药制剂的指纹图谱的建立和辨认方法和步骤，为中蒙药指纹图谱的进一步深入研究提供了线索和依据。
【关键词】指纹图谱建立和辨认研究进展
THERESEARCHPROGRESSOFmoNGOLIANINPREPARATIONFINGERPRINT
【Abstract】Thisarticlemainlyexpoundsthemongolianfingerprintofthepreparationoftheestablishmentandidentifythemethodandprocedure，thefingerprintofthemongolianforfurtherstudyofferscluesandbasis.
【Keywords】fingerprintEstablishandidentifyTheresearchprogress
中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药经适当处理后,采用一定的分析手段,提取其化学信息并加以描述,得到的能够标志该中药材或中成药特性的共有峰的图谱[1]。中蒙药是一个复杂体系,起疗效作用的物质基础不一定是一种化学成分,而是许多化学成分的总体作用。中药依赖这些化学成分起到有主次轻重的多靶点,多环节的有机整体协同治疗效果[2]。正是由于中药具有整体性和复杂性的特点,对中药的研究面临着巨大的挑战。随着近年来新技术、新方法的运用,中药复方研究出现了许多新思路,用指纹图谱研究中药复方就为其中之一。
中蒙药指纹图谱的研究已成为中药现代化进程的一个重要环节。由于中药材化学成分的复杂性，而且每一种药会有不同批次，不同产地，采摘季节和气候条件的制约，同时也存在着质量标准，定性和定量的分析，难以控制等问题。这些都给中药的深入研究和质量控制带来很大的困难。通过其化学成分的不同特性，建立指纹图谱可以解决上述亟待解决的问题。
1中药指纹图谱的建立的方法及步骤
1.1中药指纹图谱有多种构建方法，每种方法都有各自的优缺点和一定的适用范围，在实际应用中，可以根据需要进行选择。
1.1.1薄层色谱法
薄层色谱法（TLC）是色谱法中应用最广泛的方法之一。它是将样品与适宜的对照物质在同一薄层板上所得的色谱斑点作比较，用于进行定性鉴别或含量测定的方法。TLC因简单、快速、经济而被广泛应用,具有流动相组成灵活、固定相可任意改变、检测不受时间限制、薄层板可储备、能同时检测多个样品并可对所有样品进行观测等一系列优点,尤其适合于日常分析和现场检验。但由于其在一个相对开放的系统中展开,温度、湿度等外界条件影响较大,如采用自制薄层板,不确定性更大,所以TLC最好用于初步的中药材检测与鉴定[1]。虽然从仪器自动化程度、分辨率、重现性方面不如后来发展来的气相色谱和高效液相色谱法，但是由于仪器简单，操作方便，用途广泛等特点，因此广泛的被人们应用。
1.1.2高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。它具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化合应用范围广的特点。HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制,整个分离过程在相对封闭的环境内,受外界影响较小,系统稳定性好。随着HPLC设备的普及,其又能与MS、NMR等技术联用,成为中药指纹图谱研究的首要选择。
张玉杰等[3]采用反相高效液相色谱法对不同产地沙苑子进行了指纹图谱研究,结果发现不同来源的正品沙苑子指纹图谱十分相似,而与2种伪品则显示出完全不同的指纹图谱特征。邹忠梅等[4]利用HPLC-DAD方法,采用梯度洗脱,测定了10批芍药总苷样品,建立了芍药总苷的高效液相色谱指纹图谱,为科学评价及有效控制芍药的质量提供了可靠方法。瞿为民等[5]采用高效液相色谱法对人参、西洋参及三七药材指纹图谱进行了鉴别,结果表明,3种参的皂苷类成分均得到很好的分离,该方法可有效的鉴别人参、西洋参和三七参。游松等[6]采用高效液相色谱法对银杏叶注射剂进行了指纹图谱研究,结果发现所有参数均符合国家食品药品监督管理局关于有关中药注射剂的技术要求。周玉新等[7]以HPLC梯度洗脱法对三七原药材、三七总皂苷提取物及三七总皂苷注射液进行了指纹图谱的研究,证明了HPLC法可操作性强、重复性好。
1.1.3气相色谱法
气相色谱是一种柱色谱技术,它是封闭性色谱,受外界影响较少,主要用于中药中挥发油成分、极性较小的成分或衍生化后可挥发的成分的指纹图谱特征研究,它具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少和分析速度快等优点,具体应用时多与质谱技术联用。一般使用质量型检测器氢火焰离子化检测器(FID)。
1.1.4高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱
高效毛细管电泳法是以高压直流电场为驱动力,毛细管为分离通道,依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种新型电泳技术。本法具有分离模式多,分离效率高,速度快,使用范围广,进样体积小,易清洁,可直接分析水溶液等特点。主要用于中药中带电荷的化合物(如蛋白质、氨基酸、黄酮、生物碱)、有机酸、单糖及一些中性分子的分离分析,得到的指纹图谱能反映出更多的特性,使中药成分的分析范围更广泛,但毛细管电泳的检测灵敏度与精密度不如高效液相色谱法,在指纹图谱研究中应用较少[3]。
采用毛细管电泳的方法,建立10种十大功劳属植物的毛细管电泳指纹图谱,计算电泳图中每一个标记峰的有效电泳淌度和校正峰面积百分比,以对该种进行表征,测定结果显示,该属植物的电泳图有一定相似性,它们均含有小檗碱、巴马汀、药根碱,且含量较高,可作为十大功劳属植物的特征之一,用于属的鉴定。用这种方法可以进行不同种植物的鉴定以及真伪优劣的鉴别[8]。
1.1.5高速逆流色谱(HSCCC)指纹图谱
HSCCC法是目前中药分析分离中应用的一种新型液-液分配技术。该技术利用相对移动的互不混溶的两相溶剂,在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品分离。国内外已报道将高速逆流色谱技术应用于天然产物的分离和分析,该技术可适用于任何极性范围的样品,预处理要求低,一般粗提物即可满足要求,而且回收率高,能实现梯度操作,亦能重复进样,在中药质量分析控制研究中,尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。
1.1.6生物色谱指纹图:
分子生物色谱是把生物体内活性物质如酶、受体、传输蛋白等固定于色谱填料中,利用中药中活性成分与它们的相互作用,将色谱分离与分子生物医学二者的新成果紧密结合起来,建立有效成分指纹分析质量控制方法,并为组合中药的研究提供有效分子的结构信息。对于有效成分尚未清楚的中药,由于分子生物色谱以生物活性分子间广谱的相互作用为基础,也可利用其指纹分析法进行快速的质量监控。
1.1.7红外(IR)指纹图谱[9]：
红外光谱是利用分子对红外光的共振吸收,得出相应的谱线,从而提供分子结构带有不同基团的结构信息,具有指纹性。红外光谱中所反映的是中药中混合成分的叠加,中药内各种化学成分只要质和量相对稳定,样品的处理方法按统一的要求进行,则其红外光谱应该是相对稳定的,种质、地域、加工方法、贮存等外界因素的影响,从红外光谱上能够反映出各自的差异性。陈惠清等[10]采用红外指纹图谱法进行鉴别研究,证实可以通过FTIR光谱特征进行鉴别。不同产地的丹参药材红外指纹特征基本相同,采用红外指纹图谱法可以对丹参进行有效的鉴别,FTIR是中药质量宏观控制的一个快速、科学的检测手段。
1.1.8DNA指纹图谱:
中药(不含矿物质)“种属”的多样性是由于其基因多态性产生的结果,而基因多态性可在分子水平上检测,它比在形态、组成和化学水平上检测更能代表中药变异类型的遗传标记。在DNA分子水平,任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)的DNA指纹方法在中药材人参和西洋参、甘草、龟板和鳖甲、苦地胆、淫羊藿等中药鉴别方法获得成功。对独活的DNA指纹鉴别研究中,采用AP-PCR方法,3种独活样品与同属植物大活与拐芹当归DNA指纹图谱清晰,同时,方法具有可重现性。
1.1.9分子生物学方法[11]
近年来人们认识到核苷酸序列含有生命有机物构建、维持和繁殖生命所必需的遗传信息，不同种生物体含有不同的DNA序列，同种生物体既有相同的DNA序列，保持同种生物体的遗传性状，又有其多态性.使同种生物体内各个体千差万别。由于这种核苷酸序列是相对稳定的，因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图，DNA指纹图具有高度的个体特异性。限制性内切酶片段长度多态性(RFLP）是最常用的构建DNA指纹图的方法，但该法费时费力，应用受到限制。随机扩增多态DNA(RAPD)标记，可以在特异DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。
指纹图谱数据库的建立[1]：在建立复方指纹图谱前,要明确指纹图谱的性质(由哪些成分组成,这些成分是否为有效成分或与临床疗效具有相关性,或是否为有毒成分需要限量控制,成分间比例的变化是否影响成品疗效或作用方向等等)[12]。中药指纹图谱研究不仅要对不同品种、产地、采收期、药用部位和炮制方法的中药材分别建立指纹图谱,还要对中药制剂(中成药)的原药材、中间体、有效部位、最终产品的全过程建立指纹图谱库,并对指纹图谱与药效的关系进行研究,建立谱效关系库。
1.2指纹图谱研究的基本步骤[13]:
药材鉴定,确定名称、来源→选取参照物→制备供试物,样本图谱测定→列出检测数据,各项技术参数分析→建立特征指纹图谱→提供标准指纹图谱检测标准。
在指纹图谱的研究过程中，要注意到以下几点[11]：
(1)样本要有明确的纳入标准。若构建的指纹图谱用于甄别某种中药材的真伪,所选的样本应包括不同产地、不同采收期的该种药材，确保所选样本能代表该品种的样本总体；若构建的指纹图谱用于判定产地和采收期已固定的某种中药材质量是否稳定，则应尽可能收集历年来同产地、同采收期的该药材样本；若构建中成药指纹图谱，应在确保该产品所用原料产地、品种、采收期和加工方法固定的前提下，收集该药足够多的不同批号的样本，方可判定该产品的真伪及质量是否稳定。
(2)样本量要适当，样本量的实质是代表性的问题，在纳入标准明确的前提下，样本量越大，越接近总体的真实情况.抽样误差和随机误差小，代表性好，结论更可靠。但样本量大，花费的人力物力也多，有时样本来源也有困难。样本量小，则易导致偏差。因此，样本量要适当。
(3)尽可能设立对照，设立对照是构建中药指纹图谱的重要原则之一。对于中药材，可将中国药品生物制品检定所提供的标准药材作为对照品，构建该品种的“标准指纹图谱”，即标准模式。也可将公认的地道产区样品或严格按GAP要求生产的该品种药材样品作为标准对照。
如制剂与中间产品的研究步骤：首先生产工艺的实验室重复、小样制造及对不合理处的再研究,提供3批实验数据参数等.其次按成品10批、中间体10批进行指纹图谱摸底测定,按指纹图谱的研究指南进行,考查研究条件、方法的可行性等.然后进行稳定性考察,从实验开始留样,考察0、1，2，3，6，9个月与18个月的图谱稳定性,如有变化,调整图谱判定标准。
首先应注重品种情况,对资源、产销、所含化学成分及其量的现状进行调查;二是样品收集,要实地考察、收集样品并做相应的标本收集记录,按不同地域、季节分别取样;三是药材质量标准的提高,进行有效成分的提取分离,对照品的鉴定;四是药材与成品同类成分的指纹图谱研究,采用HPLC、TLCS等方法,同时要考察方法的可行性;五是确定最终使用的药材(包括产地、部位等)。
2中药指纹图谱辨认的方法和步骤
中药的化学成分极为复杂,即使对于同一种属的药材,也会因种植区域,采收时间,环境条件等多种因素的影响造成药材化学组成的差异,这便形成了它们各自的化学指纹。另外指纹图谱中各色谱峰的保留值容易受到各种因素的影响,包括操作因素和实验条件的差异。为此需要对大量的仪器分析数据进行处理,从中提取化学特征信息,进而实现化学模式识别[14,15]
2.1模糊信分析法[7]
该方法是对模糊事物进行划分、判断或推理的方法。事物的模糊性是指客观差异的中介过渡性所引起的划分上的一种不确定性。毫无疑问，中药的指纹图谱特征具有一定的模糊性，通常采用“隶属度”来反映这种模糊性，即用隶属度来判别中药的真伪。通常情况下，模糊信息的特征可以在确定性信息、随机性信息的比较中显示出来。模糊信息的特征就是这种信息给人们提供一种模糊依据，使得人们可以根据这些信息对其相应的必然规律或统计规律进行模糊识别。就中药的真伪甄别而言，计算机模糊识别的基本步骤是：(1)特征提取，即从中药的指纹图谱中获取能够反映其品质的数量化特征。(2)依照某种方式确定该中药指纹特征对“真模式”、“假模式”的隶属度(3)用最大从属原则或阈值原则确定该中药样品的真伪。
2.2人工神经网络法[16]
人工神经网络法是一门崭新的信息处理方法,它是对生物神经网络的一种数学模拟,利用大量简单的处理单元广泛连接组成复杂网络,来模仿人脑神经结构和功能,从而对信息进行处理。人工神经网络法已在许多科学领域中广泛应用,这种方法具有分布存储行计算、容错和自适应能力,可用于模式识别、数据处理、预测析组效关系等,使其在测量数据的特征提取中占重要地位。反向传播模型(BP)是目前应用最广泛的人工神经网络模型,具有判别分类可靠性大,速度快等优点。唐斌等[17]在对大量中草药质量控制实践的基础上,采用改进的BP算法和近红外光谱对中草药大黄的质量鉴别进行了研究并得到了理想的结果。该法具有样品前处理少,测定快速和非破坏性等特点,在中草药的鉴别领域具有较好的前景。目前在指纹图谱解析这方面的研究很多[18]，以上是应用较多的几种方法，另外还有主成分分析法、相似度法、向量夹角法等，作为一个能够实际应用于中药质量评价的判断标准，现阶段的指纹图谱在理论和实践上都还需要做大量的工作。在指纹图谱的构建中要注意提取方法应以保留尽量多的指纹特征为前提，还应注意不同检测器对指纹图谱的影响，选择最佳实验条件以保持图谱的完整性、代表性。在指纹图谱的分析上要克服量化指标粗糙的问题，如当对应峰的形状、大小差异较大时，重叠率不能恰当的反映图谱之间的重叠程度。另外对于成分未知的中药，确定其“关键峰”、“非关键峰”、“无意义峰”等技术参数是否合理有待商榷。用计算机来分析指纹图谱所给出的大量信息可以减少人为误差，便于推广，是指纹图谱解析的必由之路。在指纹图谱的构建与解析[19]中虽有许多问题要解决，指纹图谱还是很有发展前景的中药质控方法，它的深入研究必将推动中药的现代化、国际化，迎来中药发展的新阶段。
2.3主成分分析
该方法是变量上的信息集中到某几个综合指标(主成分)上的探索性统计分析。该法具有变差最优、信息损失最小、相关性最优等特点。李晓红等[16]碎补药材乙醇和环己烷提取物的高效液相色谱指纹图谱,并利用主成分分析法对指纹图谱进行统计分析,结果表明该方法更全面地反映了药材的化学成分信息,并能从定性和定量两方面控制骨碎补药材的内在质量。
从目前的发展状态看,指纹图谱技术应用于中药复方研究是必然的,但其研究方法和思路还有待完善。随着指纹图谱技术的逐渐成熟,相信它与中蒙药的研究结合将更为紧密,从而推动中药现代化的进程。
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