利用共培养系统揭示巨噬细胞对鹿茸干细胞的调控作用研究

论文摘要

器官的损伤或功能衰退是目前人类所面临的主要健康问题之一,我国每年因创伤或疾病造成组织或器官的缺损及功能障碍的超过400万人,目前移植新的器官是主要的应对措施,虽然免疫抑制药物以及移植免疫学有了长足的进展,但可供移植的器官来源有限,并且容易发生免疫排斥反应,要想从根本上解决问题,关键是实现缺损器官原位的再生。鹿茸是罕见的可以完全再生的哺乳动物附属器官,因此成为研究自然界哺乳动物器官完全再生的理想模型。近些年的科学研究发现,再生的发生与免疫系统的调控密切相关,但鹿茸再生过程中免疫系统的调控机制在国内外还没有报道。鹿茸的再生基于干细胞,决定鹿茸再生的干细胞定位于角柄（着生于鹿头部的永久性骨桩,鹿茸角从其上脱落与再生）骨膜中,利用成脂、成软骨诱导液诱导角柄骨膜细胞（PPCs）发现,其可向脂肪细胞和软骨细胞分化;通过免疫荧光法检测PPCs中干细胞标记因子的表达情况,结果发现,间充质干细胞表面标记物CD90、CD105、CD73、Stro-1和神经干细胞标记物Nestin在PPCs中高表达,PPCs不表达造血干细胞标记物CD34,并且其在体外培养时表现出高增殖活性。由此说明,PPCs具有干细胞的特性,是一种特殊的成体干细胞。本研究中,用巨噬细胞的条件培养液培养PPCs,并对PPCs进行转录组测序,将质控后得到的高质量测序序列与白尾鹿基因组进行比对获得mapped data,利用FPKM法计算基因表达量。以|Fold Change|≥2且FDR<0.01为筛选标准检测差异表达基因,利用DAVID软件对差异基因进行GO功能富集注释。结果显示,经过测序获得质量不低于20的碱基比例（Q20）均高于95%,共筛选到112个差异表达的基因,其中实验组有38个差异基因上调,有74个差异基因下调。实验组上调的差异基因功能富集主要涉及细胞外基质、趋化性,以及伤口愈合和生长因子刺激的反应、骨形成等生物学过程,推测巨噬细胞可能通过分泌细胞因子改变PPCs生长的微环境,调控PPCs的生理状态,使其作出免疫应答,并参与鹿茸的再生过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 绪论
•   1. 鹿茸再生模型
•     1.1 鹿茸再生的概述
•     1.2 鹿茸再生茸芽与经典再生芽基的比较
•     1.3 鹿茸干细胞
•   2. 组织器官再生中的免疫调控
•     2.1 间充质干细胞参与的免疫调控
•     2.2 巨噬细胞及其在再生中的作用
• 第二章 实验方案
•   1. 研究目的及意义
•   2. 研究的主要内容
•   3. 研究路线
• 第三章 鹿茸干细胞的采集及鉴定
•   1. 材料与试剂
•     1.1 材料与相关仪器
•     1.2 试剂
•   2. 实验方法
•     2.1 鹿茸干细胞的采集与培养
•     2.2 细胞的冻存
•     2.3 单细胞成克隆实验
•     2.4 鹿茸干细胞的鉴定
•       2.4.1 成脂诱导分化
•     2.4.1.1 成脂诱导
•     2.4.1.2 成脂鉴定
•       2.4.2 成软骨诱导（微粒体培养）
•     2.4.2.1 成软骨诱导
•     2.4.2.2 微粒体染色
•       2.4.3 免疫荧光检测
•   3. 实验结果与分析
•     3.1 鹿茸干细胞的培养及成克隆检测
•     3.2 鹿茸干细胞的鉴定
•       3.2.1 成脂诱导
•       3.2.2 成软骨的诱导
•       3.2.3 干细胞因子免疫荧光的检测
•   4. 讨论
• 第四章 巨噬细胞培养液对鹿茸干细胞生长的影响
•   1. 材料与试剂
•   2. 实验方法
•     2.1 巨噬细胞的采集与鉴定
•       2.1.1 巨噬细胞的采集
•       2.1.2 巨噬细胞的鉴定
•     2.2 条件培养液对鹿茸干细胞增殖活力的影响检测
•     2.3 条件培养液对鹿茸干细胞迁移能力的影响检测
•     2.4 条件培养液对鹿茸干细胞凋亡的影响检测
•   3. 实验结果与分析
•     3.1 巨噬细胞的染色
•     3.2 条件培养液对鹿茸干细胞增殖、迁移、凋亡的影响
•   4. 讨论
• 第五章 巨噬细胞培养液处理的鹿茸干细胞转录组分析
•   1. 材料与试剂
•   2. 实验方法
•     2.1 条件培养基处理鹿茸干细胞
•     2.2 RNA样品的准备
•     2.3 转录组测序
•     2.4 转录组测序结果验证
•       2.4.1 cDNA第一条链的合成
•       2.4.2 qPCR
•   3. 实验结果
•     3.1 RNA样品质量评价
•     3.2 转录组测序结果
•       3.2.1 转录组测序结果概述
•       3.2.2 差异基因分析
•       3.2.3 差异表达基因功能注释
•     3.3 qPCR验证测序结果
•   4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 汪珍

导师: 于威

关键词: 鹿茸再生,鹿茸干细胞,巨噬细胞,差异基因

来源: 浙江理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江理工大学

分类号: Q23

DOI: 10.27786/d.cnki.gzjlg.2019.000015

总页数: 65

文件大小: 4404K

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