Nedd4L介导CL-/HCO3-转运蛋白Pendrin泛素化修饰诱导Pendrin降解的作用研究

论文摘要

目的:泛素化是广泛存在于细胞中一种蛋白的翻译后修饰过程,泛素化过程中包含多种相关的功能蛋白,其中最主要的三种蛋白泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3,这三种酶构成特异的级联反应,将泛素标签连接在特定的底物蛋白上,结合泛素标签的底物蛋白被蛋白酶体或溶酶体识别,进一步水解成肽段或发生活性变化。结合我们对Nedd4L的研究,以及生物信息网站,Nedd4L与底物结合需要识别特定的氨基酸序列,称之为PY蛋白模序,序列由PPXY/LPXY组成,其中X代表任意氨基酸,我们检索若干感兴趣的蛋白,并寻找其氨基酸序列中是否存在PY模序,主要针对肾脏离子通道蛋白。本实验针对Nedd4L介导的Pendrin泛素化修饰进行了分子水平验证,并构建了Nedd4L的真核表达载体,在293T细胞中检测Nedd4L对Pendrin的泛素化修饰作用最终会导致Pendrin产生怎样的变化。研究方法:1、细胞培养,DMEM高糖培养基,37℃,5.0%CO2,培养293T细胞。2、小鼠肾脏组织WesternBlot检测Nedd4L表达和Pendrin表达3、Co-IP检测细胞内Nedd4L与Pendrin结合4、Nedd4L-EGFP真核表达载体构建5、细胞转染,提取转染后72小时蛋白,WesternBlot检测Nedd4L及Pendrin表达变化。6、细胞爬片,免疫荧光检测转染后Nedd4L表达情况以及Pendrin膜表达变化情况。7、Co-IP验证转染后Pendrin泛素化程度变化结果:1、Nedd4L在小鼠肾脏及293T细胞中都有较好的表达,Pendrin在小鼠肾脏和293T细胞中表达也较高。2、Co-IP实验证实Nedd4L与Pendrin存在体内结合3、转染Nedd4L72h后,Pendrin表达下降4、免疫荧光检测发现转染后Pendrin的膜定位变化5、转染后Co-IP实验,WesternBlot实验证明,Pendrin在Nedd4L表达增加的情况下泛素化程度增加结论:（1）Pendrin与Nedd4L在293T细胞内存在相互作用（2）Nedd4L可以使Pendrin泛素化（3）Nedd4L表达升高可以使Pendrin表达下降（4）Nedd4L介导Pendrin泛素化修饰可改变其膜定位.

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 1 前言
• 2 材料与方法
•   2.1 主要试剂和材料
•     2.1.1 菌株及细胞株
•     2.1.2 主要分子生物学相关实验材料
•     2.1.3 仪器设备
•     2.1.4 生物信息学及分析软件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 细胞培养
•     2.2.2 Western Blot实验
•     2.2.3 免疫共沉淀（CO-IP）
•     2.2.5 Nedd4L表达载体的构建
•     2.2.6 转染
•     2.2.7 免疫荧光
•     2.2.8 统计分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 方桂村

导师: 赵彦艳

关键词: 离子通道,泛素化

来源: 中国医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国医科大学

分类号: Q75

DOI: 10.27652/d.cnki.gzyku.2019.001522

总页数: 38

文件大小: 1576K

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