PEDV S2基因的B细胞表位嵌入型S-层蛋白载体的构建及其抗原性分析

论文摘要

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是一种可引起猪严重腹泻的猪肠道疾病,属于Ⅰ类冠状病毒。其发病主要特征是急性水样下痢、脱水和呕吐等症状,仔猪感染该病毒后具有很高的死亡率,并给养猪行业带来了巨大的经济损失。近几年来,随着分子生物学技术的飞速发展,人们对PEDV的基因结构、基因功能及致病分子机理,甚至对该病毒的检测以及预防疫苗等方面都有比较大的突破。虽然有了非常更深入的认识,但是对于全面控制PEDV的流行仍处在初步的研究阶段。本论文的研究内容及结果如下:1.本试验利用生物学软件和在线数据库中筛选出PEDV S2基因的B细胞表位,并通过Overlap PCR方法将其嵌入到嗜酸乳杆菌的S-层蛋白基因中,获得融合基因SLP-EpitopeS2。然后将融合基因SLP-EpitopeS2导入到原核表达载体pGEX-4T-3中,成功构建出了原核表达载体pGEX-SLP-EpitopeS2。2.通过PCR扩增、双酶切及基因测序结果证明融合表达载体pGEX-SLP-EpitopeS2的正确性。SDS-PAGE结果证明融合蛋白SLP-EpitopeS2的分子量为77 kDa,其中GST标签蛋白分子量大小为26 KDa,与理论值 ’致;Western blot结果证明融合蛋白SLP-EpitopeS2的正确性,能被GST血清所识别,且B细胞表位基因分别能被表位特异的鼠源单克隆抗体（McAb）和表位合成多肽所识别。3.通过切胶纯化的方法成功纯化出嵌入型蛋白GST-SLP-EpitopeS2,并免疫接种6周龄BALB/c小鼠,以GST标签蛋白与PBS作为对照组。将各组小鼠的总IgG、IgG1、IgG2a的水平,应用间接ELISA方法进行检测。试验结果表明:经第三次免疫后的血清IgG水平显著高于前两次;实验组的IgG水平极显著高于GST标签蛋白组和PBS免疫组（P<0.01）。小鼠的IgG亚型 IgG2a和 IgG11水平的检测结果显示,嵌入型蛋白 GST-SLP-EpitopeS2免疫组的IgG2a和IgG1水平均显著的高于GST标签蛋白组和PBS免疫组（P<0.01）;嵌入型蛋白GST-SLP-EpitopeS2免疫组IgG1水平显著高于IgG2a（P<0.05）,该结果提示嵌入型蛋白GST-SLP-EpitopeS2可能更倾向于激发体液免疫应答。本试验的结果进一步对PEDV S2基因的B细胞表位嵌入型蛋白SLP-EpitopeS2的抗原性和免疫保护性试验研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 引言
•   1.1 关于猪流行性腹泻的概述
•     1.1.1 猪流行性腹泻病毒
•     1.1.2 猪流行性腹泻病毒的血清型
•     1.1.3 猪流行性腹泻病毒抗原表位的研究
•     1.1.4 猪流行性腹泻病毒S基因及S蛋白的功能特性
•   1.2 关于猪流行性腹泻的研究进展
•   1.3 关于猪流行性腹泻的疫苗的研究
•     1.3.1 传统疫苗
•     1.3.2 新一代疫苗
•   1.4 关于猪流行性腹泻的预防
•   1.5 本研究的目的及意义
• 2 PEDV S表位嵌入型蛋白pGEX-SLP-EpitopeS2的纯化及鉴定
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 主要培养基及缓冲液的配制
•   2.2 方法
•     2.2.1 S2基因B细胞表位的筛选
•     2.2.2 嗜酸性乳杆菌基因组DNA的提取
•     2.2.3 SLP-EpitopeS2融合基因的制备路线
•     2.2.4 引物设计及合成
•     2.2.5 SLP-Epitope S2基因的PCR扩增
•     2.2.6 SLP-Epitope S2基因的PCR产物纯化
•     2.2.7 重组质粒pMD-SLP-EpitopeS2的构建
•     2.2.8 重组质粒pMD-SLP-EpitopeS2的酶切鉴定
•     2.2.9 原核表达载体pGEX-SLP-EpitopeS2的构建
•     2.2.10 重组质粒pGEX-SLP-EpitopeS2的鉴定
•     2.2.11 重组质粒pGEX-SLP-EpitopeS2的表达
•     2.2.12 重组菌pGEX-SLP-EpitopeS2的Western blot检测
•   2.3 结果
•     2.3.1 SLP-EpitopeS2基因PCR结果
•     2.3.2 pMD-SLP-EpitopeS2酶切鉴定结果
•     2.3.3 重组质粒pGEX-SLP-EpitopeS2的PCR鉴定
•     2.3.4 重组质粒pGEX-SLP-EpitopeS2的双酶切和测序鉴定
•     2.3.5 重组大肠杆菌的SDS-PAGE及Western blot鉴定结果
•   2.4 讨论
• 3 嵌入型蛋白SLP-EpitopeS2的免疫原性检测
•   3.1 材料
•     3.1.1 试验动物
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器设备
•   3.2 方法
•     3.2.1 嵌入型蛋白SLP-EpitopeS2的切胶纯化
•     3.2.2 免疫抗原的制备
•     3.2.3 动物的分组及免疫
•     3.2.4 血清样品收集及保存
•     3.2.5 ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体
•     3.2.6 ELISA检测免疫小鼠血清中抗体亚型IgG2a和IgG1
•   3.3 结果
•     3.3.1 嵌入型蛋白GST-SLP-EpitopeS2纯化的SDS-PAGE鉴定结果
•     3.3.2 嵌入型蛋白CGST-SLP-EpitopeS2纯化的Western blot鉴定结果
•     3.3.3 小鼠血清中总IgG的ELISA检测结果
•     3.3.4 小鼠血清中IgG亚型IgG1和IgG2a检测结果
•   3.4 讨论
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朝木丽格

导师: 格日勒图

关键词: 猪流行性腹泻病毒,细胞表位,层蛋白,原核表达,抗原性

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 内蒙古农业大学

基金: 国家自然科学基金(No.3136062)

分类号: S852.651

总页数: 50

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