多角体蛋白基因启动子论文_李俊

导读:本文包含了多角体蛋白基因启动子论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,基因,杆状,家蚕,转录,酵母,病毒。

多角体蛋白基因启动子论文文献综述

李俊^[1]（2016）在《家蚕杆状病毒多角体启动子结合蛋白筛选及39k基因功能研究》一文中研究指出多角体基因是家蚕杆状病毒(BmNPV)极晚期表达基因,因其启动子的超高效的启动功能,常被当作昆虫杆状病毒表达系统中启动外源基因表达的启动子,但其高效启动机制还鲜见报道。因此,在前期研究中,我们将多角体启动子序列作为诱饵,利用酵母单杂交筛选出了多种能与多角体启动子相互作用的蛋白因子,包括38K、39K、LEF5、P6.9、ORF60、ORF61、FP25、GP64、V-CATH。为进一步检测上述蛋白因子对BmNPV多角体启动子的调控作用,构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶检测系统,通过定量检测萤光素酶活性的变化筛选出多角体启动子正调控因子LEF5,负调控因子39K和ORF61,其他因子调控作用不明显。39k同源基因存在于所有鳞翅目昆虫的杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白。迄今的研究表明,39k基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(BmNPV)39k基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚,为了深入了解该基因的功能,我们检测发现39k基因为早期转录基因,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和补回39k基因,构建了39k缺失型病毒39k-ko-Bacmid和修复型病毒39k-re-Bacmid,并分别转染BmN细胞,病毒滴度检测结果显示二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39k基因是BmNPV复制的非必需基因,但是该基因的缺失可显着降低病毒滴度。进一步利用荧光定量qPCR技术进行检测,发现39k基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显着影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显着下降(p<0.01)。综上所述,利用双萤光素酶报告基因检测出多角体启动子正调控因子为LEF5,负调控因子为39K和ORF61,进一步研究可知39k基因是BmNPV复制的非必需基因,但该基因的缺失可显着降低病毒各时期基因的转录水平,本研究将为深入了解BmNPV 39k基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒表达系统高效转录机制的研究提供新基础。(本文来源于《浙江理工大学》期刊2016-03-11）

余海鹏^[2]（2015）在《BmNPV多角体基因（polh）启动子结合蛋白的研究》一文中研究指出多角体启动子在杆状病毒表达系统中被广泛应用,因其具有高效启动外源基因表达的能力,但是其调控机制迄今为止还尚阐明。因此,在本研究中以家蚕杆状病毒(Bm NPV)多角体基因polh启动子为研究对象,利用酵母单杂交技术筛选与多角体启动子序列相结合的蛋白因子,并对筛选蛋白因子的功能进行了研究。首先提取感染了Bm NPV的家蚕Bm N细胞内总RNA,逆转录为c DNA,构建基因表达文库。然后,利用酵母单杂交系统筛选与多角体启动子序列结合的蛋白。通过筛选、测序,共鉴定出18个能与polh启动子序列相互作用的蛋白。通过生物信息学分析,挑选了3个基因(lef5、orf61和p6.9)作进一步研究。为验证筛选出基因的功能,分别将原核表达并纯化的叁种蛋白:lef5、orf61和p6.9进行EMSA分析,结果表明,orf61能与polh的启动子序列相互作用。为了进一步鉴定叁种蛋白的功能,利用瞬时表达系统,构建lef5、orf61和p6.9的瞬时表达载体,转染病毒Bacimd-Luc感染的Bm N细胞,定量检测报告基因Luc的表达情况。结果显示lef5、orf61和p6.9均对polh启动子具有正调控作用。然后,又利用基因敲除技术,进一步研究了3个基因的功能。通过Red重组技术构建了基因敲除型病毒lef5-ko-Bacmid、orf61-ko-Bacmid和p6.9-ko-Bacmid,通过Bac-to-Bac系统构建了补回型病毒lef5-re-Bacmid、orf61-re-Bacmid和p6.9-re-Bacmid,然后将构建的病毒分别转染家蚕Bm N细胞。研究发现lef5、orf61和p6.9缺失型病毒TCID50均为0,修复型病毒与野生型病毒TCID50无明显差异(p>0.05),说明3种基因缺失均导致不能形成有感染活性的病毒粒子(BV)。其中,orf61缺失型对病毒基因组复制有显着影响(p<0.05),lef5和p6.9没有明显影响(p>0.05),说明orf61可能是病毒基因组复制的必需基因。此外,为了了解3种基因的缺失对Bm NPV其他基因表达的影响,选取了病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10进行荧光定量PCR分析,实验结果表明,3种基因的缺失,均会对病毒的早期、晚期和极晚期基因的转录水平有显着影响(p<0.05)。综上所述,利用酵母单杂交技术筛选获得的lef5、orf61和p6.9,其中证明ORF61蛋白可与Bm NPV polh启动子序列相结合,它们的表达水平可直接影响polh的启动和表达水平;此外,3种基因对Bm NPV的早期、晚期和极晚期基因的转录水平也有显着影响。本研究工作将为阐明杆状病毒表达系统的高效表达机制和病毒载体系统的改造奠定基础。(本文来源于《浙江理工大学》期刊2015-01-09）

李佳^[3]（2011）在《应用酵母单杂交技术筛选BmNPV多角体基因启动子的结合蛋白》一文中研究指出在杆状病毒表达系统中,多角体基因启动子在调控外源基因表达方面起了至关重要的作用。但其高效转录及调控机制到目前为止还不是很清楚。本研究以家蚕杆状病毒(BmNPV)为研究对象,利用酵母单杂交技术筛选其多角体基因高效转录过程中与启动子序列相互作用的结合蛋白。通过提取感染BmNPV第5天的家蚕五龄幼虫脂肪体组织的总RNA,利用RT-PCR技术建立了家蚕五龄幼虫组织的基因表达文库,同时设计并合成了用于调控因子筛选的多角体基因启动子核心序列,采用酵母单杂交系统从构建的家蚕脂肪体组织cDNA文库中筛选与该核心启动子序列相互作用的蛋白因子。经过多轮筛选后,共获得12个阳性克隆仍保持AbA抗性,提取相应酵母菌单克隆中的质粒进行测序分析,发现它们分别属于3个不同蛋白的cDNA克隆。进一步对筛选出的cDNA序列进行生物信息学分析,发现它们分别编码宿主来源的核糖体蛋白RPSA (ribosome protein derived, RPSA)、核糖体蛋白RPL5 (ribosome protein derived, RPL5)和核型多角体病毒DNA结合蛋白(DBP)。为进一步验证筛选出的蛋白因子RPSA和DBP对多角体基因启动子活性的影响,分别将RPSA和DBP基因插入瞬时表达载体pSK-IE中,转染BmN细胞,24 h后感染重组病毒Bacmid-Luc,然后检测荧光素酶的表达量。结果表明RPSA蛋白和DBP蛋白对多角体基因转录均具有正调控作用。RNAi检测结果表明.RPSA和DBP干扰后对多角体基因转录水平均具有下调作用。本研究工作从分子水平探索了多角体基因启动子高效转录、表达的作用机制,为今后深入研究杆状病毒启动子转录机制提供了新基础。(本文来源于《浙江理工大学》期刊2011-12-01）

多角体蛋白基因启动子论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

多角体启动子在杆状病毒表达系统中被广泛应用,因其具有高效启动外源基因表达的能力,但是其调控机制迄今为止还尚阐明。因此,在本研究中以家蚕杆状病毒(Bm NPV)多角体基因polh启动子为研究对象,利用酵母单杂交技术筛选与多角体启动子序列相结合的蛋白因子,并对筛选蛋白因子的功能进行了研究。首先提取感染了Bm NPV的家蚕Bm N细胞内总RNA,逆转录为c DNA,构建基因表达文库。然后,利用酵母单杂交系统筛选与多角体启动子序列结合的蛋白。通过筛选、测序,共鉴定出18个能与polh启动子序列相互作用的蛋白。通过生物信息学分析,挑选了3个基因(lef5、orf61和p6.9)作进一步研究。为验证筛选出基因的功能,分别将原核表达并纯化的叁种蛋白:lef5、orf61和p6.9进行EMSA分析,结果表明,orf61能与polh的启动子序列相互作用。为了进一步鉴定叁种蛋白的功能,利用瞬时表达系统,构建lef5、orf61和p6.9的瞬时表达载体,转染病毒Bacimd-Luc感染的Bm N细胞,定量检测报告基因Luc的表达情况。结果显示lef5、orf61和p6.9均对polh启动子具有正调控作用。然后,又利用基因敲除技术,进一步研究了3个基因的功能。通过Red重组技术构建了基因敲除型病毒lef5-ko-Bacmid、orf61-ko-Bacmid和p6.9-ko-Bacmid,通过Bac-to-Bac系统构建了补回型病毒lef5-re-Bacmid、orf61-re-Bacmid和p6.9-re-Bacmid,然后将构建的病毒分别转染家蚕Bm N细胞。研究发现lef5、orf61和p6.9缺失型病毒TCID50均为0,修复型病毒与野生型病毒TCID50无明显差异(p>0.05),说明3种基因缺失均导致不能形成有感染活性的病毒粒子(BV)。其中,orf61缺失型对病毒基因组复制有显着影响(p<0.05),lef5和p6.9没有明显影响(p>0.05),说明orf61可能是病毒基因组复制的必需基因。此外,为了了解3种基因的缺失对Bm NPV其他基因表达的影响,选取了病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10进行荧光定量PCR分析,实验结果表明,3种基因的缺失,均会对病毒的早期、晚期和极晚期基因的转录水平有显着影响(p<0.05)。综上所述,利用酵母单杂交技术筛选获得的lef5、orf61和p6.9,其中证明ORF61蛋白可与Bm NPV polh启动子序列相结合,它们的表达水平可直接影响polh的启动和表达水平;此外,3种基因对Bm NPV的早期、晚期和极晚期基因的转录水平也有显着影响。本研究工作将为阐明杆状病毒表达系统的高效表达机制和病毒载体系统的改造奠定基础。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。