HSPD1胞内介导猪链球菌2型烯醇化酶诱导脑微血管内皮细胞凋亡的机制

论文摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis Type 2,SS2）是诱发细菌性脑膜炎的一种重要病原菌,烯醇化酶（Enolase,ENO）是SS2感染诱发脑膜炎过程中的重要毒力分子。本课题组前期发现猪链球菌2型烯醇化酶（SS2-ENO）诱导脑微血管内皮细胞（BMEC）凋亡过程中,细胞热休克蛋白60（HSPD1）含量显著升高,但其具体作用尚不明确。因此,本研究针对HSPD1介导SS2-ENO诱导脑微血管内皮细胞凋亡机制展开以下研究。为探讨HSPD1在ENO诱导BMEC凋亡中的作用,本研究通过Western blot、等方法,分析HSPD1含量对BMEC凋亡的影响。研究结果表明:ENO诱导细胞凋亡过程中,胞内和胞外HSPD1含量升高。且胞内过表达HSPD1和胞外添加HSPD1可促进ENO诱导的细胞凋亡;胞内敲低HSPD1和胞外抗体阻断HSPD1,会抑制该凋亡。证明HSPD1可促进ENO诱导的细胞凋亡。为研究HSPD1在ENO诱导细胞凋亡过程中的定位,本研究通过荧光标记等方法进行分析。结果显示,在ENO诱导细胞凋亡过程中,线粒体HSPD1含量逐渐减少,胞浆HSPD1含量逐渐增多,HSPD1逐渐由线粒体向胞浆转移。线粒体渗透性也随之改变。说明ENO诱导细胞凋亡过程中,线粒体膜渗透性增大,致使HSPD1由线粒体向胞浆、进而向胞外发生转移。进一步对胞内胞外HSPD1介导细胞凋亡的分子机制进行研究。通过Co-IP、免疫荧光染色等方法验证胞内HSPD1的互作蛋白并分析其参与的信号通路,发现胞内HSPD1的互作蛋白为actin,并通过Smac-XIAP-Caspase 3信号通路介导凋亡发生。TLR4介导了胞外HSPD1诱导细胞凋亡的过程。最后为验证HSPD1对血脑屏障（BBB）通透性的影响,以体外BBB共培养模型和健康小鼠进行实验。结果显示体外模型添加HSPD1或小鼠尾静脉注射HSPD1后,体外BBB模型的TEER值显著降低,小鼠体内脑组织摄入的伊蓝染料浓度升高,证实HSPD1可以增加BBB的通透性。本研究证实,ENO诱导的脑微血管内皮细胞凋亡,可使胞内胞外HSPD1含量升高,并由线粒体向胞浆、胞外转移,增加血脑屏障的通透性。该研究阐明了HSPD1对细胞凋亡的作用及其对BBB通透性的影响,丰富了人们对HSPD1功能上的认识,也为SS2脑膜炎致病机制的研究提供重要的理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 引言
• 第一篇 文献综述
•   第1章 烯醇化酶致病性的研究进展
•     1 ENO的结构、生物学功能及分布
•     2 原核生物ENO与疾病的关系
•       2.1 革兰氏阳性菌ENO诱导的疾病
•       2.2 革兰氏阴性菌ENO诱导的疾病
•       2.3 猪链球菌ENO诱导疾病的研究进展
•     3 真核生物ENO与疾病的关系
•       3.1 真核生物ENO与脑部疾病
•       3.2 真核生物ENO与癌症
•       3.3 真核生物ENO与免疫相关疾病
•   第2章 HSPD1诱导细胞凋亡的研究进展
•     1 HSPD1的结构、分布与功能
•     2 HSPD1与疾病的关系
•     3 HSPD1定位与疾病的关系
•     4 HSPD1与细胞凋亡的关系
•       4.1 胞外HSPD1与凋亡的关系
•       4.2 胞内HSPD1与凋亡的关系
• 第二篇 研究内容
•   第1章 Eno诱导HSPD1的含量变化及与BMEC凋亡的关系
•     1 材料
•       1.1 主要试剂材料
•       1.2 主要仪器设备
•     2 方法
•       2.1 重组蛋白表达载体p ET28a-HSPD1的构建
•       2.2 重组蛋白HSPD1的表达及纯化
•       2.3 HSPD1蛋白表达情况
•       2.4 Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡情况
•       2.5 干扰HSPD1和过表达HSPD1对ENO诱导细胞凋亡的影响
•     3 结果
•       3.1 HSPD1蛋白的表达纯化
•       3.2 ENO作用下,HSPD1促进细胞凋亡的发生
•     4 讨论
•     5 小结
•   第2章 HSPD1异常定位诱导BMEC凋亡
•     1 材料
•       1.1 主要试剂材料
•       1.2 主要仪器设备
•     2 方法
•       2.1 HSPD1亚细胞含量变化检测
•       2.2 抑制HSPD1的亚细胞含量对细胞凋亡影响
•       2.3 激光共聚焦观察HSPD1定位
•       2.4 线粒体渗透性功能检测
•     3 结果
•       3.1 ENO诱导细胞凋亡过程中,HSPD1亚细胞含量变化
•       3.2 ENO诱导细胞凋亡过程中,HSPD1发生异常定位
•       3.3 HSPD1异常定位过程中线粒体渗透性增加
•     4 讨论
•     5 小结
•   第3章 HSPD1互作蛋白筛选及其与凋亡的关系
•     1 材料
•       1.1 主要试剂和材料
•     2 方法
•       2.1 互作蛋白筛选
•       2.2 ACTB的表达量及形态观察
•       2.3 信号通路途径
•     3 结果
•       3.1 HSPD1互作蛋白筛选鉴定
•       3.2 HSPD1互作蛋白ACTB在细胞凋亡过程中变化
•       3.3 胞内HSPD1诱导细胞凋亡的分子机制
•       3.4 胞外HSPD1诱导细胞凋亡的分子机制
•     4 讨论
•     5 小结
•   第4章 HSPD1诱导BMEC凋亡对血脑屏障通透性影响
•     1 材料
•       1.1 材料和试剂
•     2 方法
•       2.1 HSPD1刺激体外血脑屏障模型的建立
•       2.2 HSPD1刺激体内血脑屏障模型的建立
•       2.3 脑部EB含量分析
•       2.4 免疫组织化学染色及光密度分析小鼠脑HSPD1含量
•     3 结果
•       3.1 体外实验证明HSPD1可以增加血脑屏障通透性
•       3.2 体内实验证明HSPD1可以增加血脑屏障通透性
•       3.3 SS2 感染和ENO刺激可使脑组织中HSPD1表达升高
•     4 讨论
•     5 小结
• 结论
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介及在学期间所取得的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 贾丽

导师: 雷连成

关键词: 猪链球菌型,脑膜炎,细胞凋亡,血脑屏障

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

分类号: S852.61

总页数: 83

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