酿酒酵母中G4 DNA的结构特征及其对Pif1解旋活性调节的研究

论文摘要

G4（G-quadruplex）DNA是一类特殊的DNA二级结构,其核心结构是四个鸟苷酸通过氢键形成的G-四分体平面,当两个以上的平面在一价阳离子Na+或K+的稳定下,就形成了G4结构。G4结构广泛存在于基因组中,并且在DNA复制、转录、端粒代谢等多种生命活动中发挥着重要的作用。因此,正确的处理G4结构对维持基因组稳定性意义重大。解旋酶是一种分子马达蛋白,它依靠水解ATP获得能量来打开核酸之间的氢键。酿酒酵母解旋酶Pif1（S.cerevisiae Pif1）是一类5’-3’DNA解旋酶,它不仅具有极强的G4解旋能力,而且在抑制端粒酶活性、促进冈崎片段的加工成熟以及核糖体DNA复制等过程中都发挥着重要作用。尽管酵母体内G4 DNA的数量及分布已经通过生物信息学的方法得到,但是其结构特征仍然未知,Pif1对不同G4结构的解旋偏好性也不清楚。本文随机选取了酵母体内的83条可能形成G4结构的序列,利用smFRET（单分子荧光共振能量转移）、CD光谱和FRET熔化等实验手段,系统的探究了酵母体内G4的结构特性及其与Pif1作用的机理,得到以下结论:（1）酵母基因组中能够形成G4结构的序列长度在30-60个碱基之间,超过60个碱基,很难形成G4结构。并且随着G4序列的增长,G4结构的稳定性逐渐降低。（2）酵母中G4 motif序列在体外能够形成各种loop长度的G4结构,最短的loop长度为1个碱基,最长的能达到30个碱基以上。在形成的这些G4结构中,平行结构是主要的构型。（3）Pif1对不同类型的G4具有不同的解旋效率,G4结构的热稳定性、构型以及loop长度等都是影响解旋效率的重要因素。Pif1更容易解开热稳定性差、反平行结构的、长loop G4。（4）Pif1解旋G4的速率影响其解旋下游双链,G4结构既能促进也能抑制Pif1的解旋活性。（5）酵母中的G4结构大都具有较长的loop,并且稳定性较低。因此Pif1能解开酵母体内的大部分G4结构。但是对于那些loop较短,稳定性较强的G4,Pif1很难解开,因此可能需要其它的解旋酶来打开这些G4结构。传统的计算方法一般认为G4 loop长度不超过7个碱基,本实验首次报道了酵母基因组中的G4序列能在体外形成loop长度超过30个碱基的G4,这大大刷新了我们对G4结构的认识。另外,Pif1能解开酵母体内的大部分G4,再次证明了其强大的解旋能力,同时也缩小了对基因组稳定性构成挑战的G4部分,有助于理解Pif1介导的不同G4结构对基因组稳定性的影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 G4结构概述及研究进展
•     1.1.1 G4 DNA概述
•     1.1.2 G4 DNA结构特征
•     1.1.3 G4 DNA的生物学功能
•     1.1.4 酵母中的G4 DNA
•   1.2 解旋酶概述
•     1.2.1 解旋酶概述
•     1.2.2 G4 解旋酶生物学功能研究
•     1.2.3 Pif1 解旋酶与G4 相互作用研究
•   1.3 实验中的研究方法及技术
•     1.3.1 单分子技术
•     1.3.2 圆二色谱
•     1.3.3 荧光各向异性（Fluorescence Anisotropy）
•     1.3.4 荧光共振能量转移熔化（FRET Melting）
•   1.4 研究目的和意义
• 第二章 酵母中G4 DNA的结构特征
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验方法
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 酵母中DNA序列能形成G4 结构
•     2.3.2 G4 结构的稳定性特征
•     2.3.3 G4 结构的构型特征
•   2.4 讨论
• 第三章 Pif1 与不同类型G4 结构相互作用机理研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验方法
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 Pif1 对不同结构G4 具有不同的解旋效率
•     3.3.2 Pif1对G4 的解旋速率影响下游双链的解旋
•     3.3.3 G4 热稳定性对Pif1 解旋的影响
•     3.3.4 G4 构型对Pif1 解旋的影响
•     3.3.5 G4 loop对 Pif1 解旋的影响
•     3.3.6 Pif1 能解开酵母体内的大部分G4 结构
•   3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王雷

导师: 侯锡苗

关键词: 酿酒酵母,解旋酶,单分子,基因组稳定性

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金基金(编号:11574252)

分类号: Q78

总页数: 76

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