导读:本文包含了高糖孵育论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:细胞,心肌,利多,基因,活性氧,平滑肌,内皮。
高糖孵育论文文献综述
曹小舟[1]（2017）在《小肽AREGEM的抗氧化性及其对高糖孵育的血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响》一文中研究指出大量研究表明:氧化应激与心血管疾病、癌症、糖尿病及其并发症等多种慢性疾病的发生、发展密切相关,应用抗氧化治疗可逆转氧化应激对组织的损伤,从而阻止或延缓各种疾病的发生、发展。本课题以筛选得到的高活性肽为研究对象,用高糖孵育血管平滑肌细胞(VSMCs),进一步确证小肽在细胞水平的生物抗氧化性,并探讨小肽对高糖孵育的VSMCs增殖和凋亡的影响。主要研究内容及结果如下:1.体外化学法评价小肽AREGEM的抗氧化性。以筛选出的麦胚抗氧化肽序列AREGETWPG为基础,通过对肽序列进行修饰,得到MAREGETVVPG、MAREGE、AREGEM这几条序列。采用基于氢原子转移反应机制和电子转移反应机制的体外化学法,对这几条小肽的抗氧化活性进行了初步的评价。筛选出了高活性的抗氧化肽序列:AREGEM。2.进一步验证小肽AREGEM在细胞水平的生物抗氧化活性。以肽序列AREGEM为研究对象,采用体外培养VSMCs,研究小肽对高糖诱导的VSMCs内活性氧(ROS)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响。在高糖中加入不同浓度的抗氧化肽后,与高糖组相比,可以显着降低细胞内ROS的水平,提高VSMCs中的T-AOC、GSH-Px和SOD酶水平,显着降低细胞中MDA的水平。说明抗氧化肽可以通过增加机体清除自由基的能力、减少脂质过氧化反应和脂质过氧化产物的生成发挥其抗氧化作用,从而维持细胞的稳定状态,发挥其保护细胞的功能。3.从增殖率和细胞周期等方面来探究小肽AREGEM对高糖孵育的VSMCs增殖的影响。MTT法证明一定浓度的抗氧化肽AREGEM可以保护细胞,有效抑制高糖引起的VSMCs增殖过快。尤其当肽的浓度为45μM时,VSMCs的增殖率降到了 104.41±4.36%(p<0.01),达到了和对照组一致的水平。同时,低浓度的抗氧化肽AREGEM对细胞生长没有任何影响(p>0.05)。实验结果表明抗氧化肽对VSMCs既无促进生长作用,也无抑制生长作用。碘化丙啶(PI)单染法证明高糖环境可以使G0/G1期的VSMCs数目减少,进入S期的细胞数目明显增多。加入不同浓度(15 μM和45 μM)的小肽处理后,实验组被阻滞于Go/G1期的细胞上升,而S期的细胞数目减少,增殖指数也显着降低。实验结果表明小肽AREGEM主要是抑制高糖诱导的Go/G1期细胞进入S期,从而抑制细胞增殖的进程。4.探讨了小肽AREGEM对高糖孵育的血管平滑肌细胞凋亡的影响。采用荧光显微镜观察结合现代凋亡检测技术,检测细胞的凋亡。在此基础上,选取与细胞凋亡相关的蛋白或基因,采用Western Blotting,从生物分子水平及免疫学角度,来研究抗氧化肽对高糖抑制VSMCs凋亡的影响。Hoechst 33258染色法和AnnexinV-FITC/PI双染法实验结果都表明:高糖环境抑制VSMCs的凋亡,加入小肽处理后,可以减弱这种抑制作用。小肽可以减弱高糖环境抑制VSMCs的凋亡,可能与降低细胞内Caspase-3的活性与降低细胞内Bcl-2/Bax的比值有关。此外,由于高糖环境使细胞内ROS的水平增高,导致AKT的Ser473位点磷酸化水平增高;加入小肽后,也可以降低高糖孵育的VSMCs内AKT的磷酸化水平。(本文来源于《南京财经大学》期刊2017-04-20）
李慕蓉[2]（2016）在《降钙素基因相关肽对低糖/高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响》一文中研究指出目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)后处理对低糖/高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响,并探讨CGRP的保护机制。方法:1.心肌细胞培养、鉴定方法及建立H/R模型。选取健康出生72小时以内的SD大鼠,取出并剪碎心脏,Ⅱ型胶原酶反复消化数次,离心后取上清接种于六孔细胞培养板培养72小时。对心肌细胞特有的横纹肌肌动蛋白使用免疫组化SABC法对心肌细胞进行鉴定。培养72小时后,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,缺氧/复氧结束之后使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率。2.CGRP对乳鼠心肌细胞H/R损伤的影响。将培养72小时的心肌细胞选取12孔细胞进行实验并随机分成四组(n=3):(1)对照组:不处理不加药;(2)H/R组:更换缺氧液缺氧3小时,更换DMEM复氧2小时;(3)H/R+CGRP组:更换缺氧液缺氧3小时,更换含有10-8mmol/L CGRP的DMEM,复氧2小时;(4)H/R+CGRP+CGRP8-37组:提前1小时更换含有10-7mmol/L的CGRP8-37的DMEM,更换缺氧液缺氧3小时,更换含有10-8mmol/L的CGRP的DMEM,复氧2小时。将四组心肌细胞按照以上方法处理后,使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率;收集上清液,ELISA法测定各孔心肌细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的浓度。3.CGRP对原代培养乳鼠心肌细胞H/R损伤保护的机制。按照方法2进行分组及处理,使用JC-1测定心肌细胞线粒体膜电位(MMP)变化,使用Fluo-3 AM和Rhod-2AM分别测定细胞内及线粒体内的钙浓度,使用DCFH-DA测定细胞内的活性氧浓度。4.CGRP对高糖孵育心肌细胞H/R损伤的影响。心肌细胞分别用低糖DMEM及高糖DMEM孵育,将培养72小时的心肌细胞选取15孔进行实验并随机分成5组(n=3):(1)低糖对照组(LG):心肌细胞全程使用低糖DMEM孵育,不进行缺氧/复氧的处理,不更换缺氧液,也不添加任何药物的干预;(2)高糖对照组(HG):心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,不进行缺氧/复氧的处理,不更换缺氧液,也不添加任何药物的干预;(3)高糖缺氧/复氧组(HG+H/R):心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,不添加任何药物的干预;(4)HG+H/R+CGRP组:心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,在缺氧结束后复氧开始前更换DMEM时加入CGRP(10-8mmol/L);(5)HG+H/R+CGRP+CGRP8-37组:心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,提前1小时加入CGRP8-37(10-7mmol/L),缺氧3小时,更换DMEM时加CGRP(10-8mmol/L)复氧2小时。将五组心肌细胞按照以上方法处理后,使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率;收集上清液,ELISA法测定各孔心肌细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的浓度。5.CGRP对高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤保护的机制。按照方法4进行分组及处理,使用Fluo-3 AM和Rhod-2 AM分别测定细胞内及线粒体内的钙浓度,使用DCFH-DA测定细胞内的活性氧浓度。结果:1.心肌细胞培养成功,在显微镜下观察、拍照并计数,所需心肌细胞的数量占所有细胞数量总和的90%以上。2.成功建立H/R损伤,凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。3.H/R组心肌细胞凋亡率、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度、培养基中LDH和caspase-3的浓度比对照组明显升高(P<0.05),MMP明显下降(P<0.05);通过与H/R组的对比,观察H/R+CGRP组心肌细胞的凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内的活性氧浓度、细胞内及线粒体内的钙浓度均明显下降(P<0.05),MMP明显升高(P<0.05);并且CGRP的特异性拮抗剂CGRP8-37可以逆转CGRP对缺氧/复氧心肌细胞的作用。4.与LG组比较,HG组心肌细胞凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞内及线粒体内的钙浓度均明显升高(P<0.05);与HG组比较,HG+H/R组心肌细胞凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度均明显升高(P<0.05);与HG+H/R组比较,HG+H/R+CGRP组心肌细胞的凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度均明显下降(P<0.05);并且CGRP的特异性拮抗剂CGRP8-37可以逆转CGRP对缺氧/复氧心肌细胞的作用。结论:1.心肌细胞经过H/R处理后导致细胞损伤,CGRP后处理可以减轻H/R对心肌细胞的损伤,CGRP8-37可以逆转CGRP的作用。2.高糖DMEM孵育对心肌细胞造成了损伤,缺氧/复氧可以加重高糖孵育心肌细胞的损伤,CGRP后处理可以减轻高糖孵育心肌细胞的缺氧/复氧损伤,CGRP8-37可以逆转这种保护作用。3.CGRP发挥心肌保护作用的机制与其升高MMP、降低细胞内及线粒体内钙浓度和细胞内活性氧浓度有关。(本文来源于《山西医科大学》期刊2016-05-25）
陈璐[3]（2014）在《降钙素基因相关肽对高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响》一文中研究指出目的探讨降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP)预先给药对正常大鼠心肌细胞以及高糖孵育大鼠心肌细胞缺氧/复氧(Anoxia-reoxygenation, A/R)损伤的影响。方法(1)乳鼠心肌细胞体外培养与鉴定。选用健康1-3天龄的SD大鼠,雌雄不拘,用于心肌细胞体外培养模型的建立。采用免疫细胞化学SABC法对所培养的心肌细胞进行鉴定。(2)心肌细胞缺氧/复氧模型的建立。将培养72h的心肌细胞置于密闭缺氧盒中培养3h模拟缺氧,更换培养液后在正常培养箱中培养2h模拟复氧,缺氧/复氧结束后检测心肌细胞凋亡率。(3)采用免疫荧光技术对心肌细胞中CGRP受体的分布进行定位。(4) CGRP对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。采用随机数字表法,取12孔心肌细胞随机分为4组(n=3)：对照组,不加任何药物干预,并且不进入缺氧/复氧程序；缺氧/复氧组,不加任何药物干预,只进行缺氧/复氧程序；缺氧/复氧+CGRP组,缺氧前1小时给予CGRP (10-8mol/L),之后进入缺氧/复氧程序；缺氧/复氧+CGRP+CGRP8.37组,缺氧前1小时给予CGRP(10-8mol/L)+CGRP1受体拮抗剂CGRP8-37(10-7mol/L),之后进入缺氧/复氧程序。缺氧/复氧损伤后测定心肌细胞凋亡率、乳酸脱氢酶(LDH)释放量以及培养液中半胱氨酸天冬蛋白酶3(caspase-3)活性。(5) CGRP对高糖孵育大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。用低糖和高糖DMEM培养基孵育原代培养的SD大鼠心肌细胞建立高糖损伤模型,培养72h后进入缺氧/复氧程序,于缺氧前随机分为5组,分别为低糖对照组,高糖组,高糖缺氧/复氧组,高糖缺氧/复氧+CGRP组和高糖缺氧/复氧+CGRP+CGRP8-37组。缺氧/复氧损伤后测定细胞凋亡率、培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量以及半胱氨酸天冬蛋白酶3(caspase-3)活性。(6)观察CGRP对缺氧/复氧损伤高糖孵育大鼠心肌细胞线粒体通透性转换的影响。用低糖和高糖DMEM培养基孵育原代培养的SD大鼠心肌细胞建立高糖损伤模型,培养72h后进入缺氧/复氧程序,于缺氧前随机分为5组,分别为低糖对照组,高糖组,高糖缺氧/复氧组,高糖缺氧/复氧+CGRP组和高糖缺氧/复氧+CGRP+CGRP8-37组。缺氧/复氧损伤后Calcein-AM装载,激光共聚焦成像,观察细胞MPTP的开放情况。结果(1)乳鼠心肌细胞体外培养成功,经检测,心肌细胞占所培养细胞总数的90%以上。(2)心肌细胞缺氧/复氧模型建立成功,缺氧/复氧后心肌细胞的凋亡率明显增高。(3)正常心肌细胞中存在大量的CGRP受体,且在细胞核和细胞质中都有分布。(4)与对照组比较,缺氧/复氧组的细胞凋亡率、LDH释放量以及培养液中caspase-3活性均显着升高(p均<0.01)；缺氧/复氧+CGRP组的细胞凋亡率、LDH释放量以及培养液中caspase-3活性均显着低于单纯缺氧/复氧组(p均<0.01),上述指标变化可被CGRP1受体拮抗剂CGRP8-37所逆转。(5)与低糖对照组比较,高糖组的细胞凋亡率、培养液上清中LDH含量以及caspase-3活性均显着升高(p均<0.01)；高糖缺氧/复氧组的细胞凋亡率、培养液上清中LDH含量以及caspase-3活性均显着高于单纯高糖组(p均<0.01)；而高糖缺氧/复氧+CGRP组细胞凋亡率、培养液上清中LDH含量以及caspase-3活性则显着低于高糖缺氧/复氧组(p均<0.01),上述指标变化可被CGRP1受体拮抗剂CGRP8-37所逆转。(6)激光共聚焦显微镜观察各组心肌细胞内Calcein的分布情况,低糖对照组、高糖A/R+CGRP组心肌细胞Calcein保留在线粒体内,胞浆荧光强度较弱,提示MPTP未开放,其余各组Calcein从线粒体释放到胞浆和胞核,胞浆荧光强度较强,提示MPTP开放。测量荧光值各组无统计学差异。结论(1)缺氧/复氧可诱发心肌细胞损伤,CGRP预先给药可显着减轻心肌细胞在缺氧/复氧过程中的损伤,该作用可能由CGRP1受体介导。(2)高糖孵育可诱发心肌细胞损伤,缺氧/复氧可诱导高糖孵育的大鼠心肌细胞更为严重的损伤,CGRP预先给药可显着减轻心肌细胞在缺氧/复氧过程中的损伤,该作用可能由CGRP1受体介导。(3) CGRP发挥心肌保护作用可能和抑制线粒体通透性转换有关。(本文来源于《山西医科大学》期刊2014-05-28）
赵鑫[4]（2014）在《P物质对高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响》一文中研究指出目的P物质（substance P，SP）预先给药对正常乳鼠心肌细胞以及高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧（Anoxia-reoxygenation，A/R）损伤的影响。方法（1）体外培养乳鼠心肌细胞模型的建立及糖尿病模型和缺氧/复氧损伤模型的制作。选用1~3日龄的健康SD大鼠，雌雄不拘，用于心肌细胞体外培养模型的建立，采用免疫细胞化学SABC法进行心肌细胞鉴定；使用25mmol/L葡萄糖浓度的DMEM培养基孵育心肌细胞，制作糖尿病模型；将培养72h的心肌细胞更换缺氧液后置于密闭缺氧盒中培养3h模拟缺氧，随后更换培养液在正常培养箱中培养2h模拟复氧建立缺氧/复氧损伤模型，测定缺氧液及密闭缺氧盒中的氧分压验证缺氧情况。（2）采用免疫荧光技术对心肌细胞速激肽1型受体（neurokinin-1receptor，NK-1）的分布表达进行定位。（3）SP对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。取12孔心肌细胞随机分为4组（n=3）：对照组；A/R组，不加任何药物，只进行缺氧/复氧；SP+A/R组，给予SP（10-7mol/L）作用1h后进行缺氧/复氧；SP+D-SP+A/R组，给予SP（10-7mol/L）和NK-1受体拮抗剂D-SP（10-6mol/L）作用1h后进行缺氧/复氧。每组分别采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡率，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组心肌细胞蛋白中、缺氧液中和复氧液中的半胱氨酸天冬蛋白酶3（caspase-3）活性，采用LDH检测试剂盒检测各组缺氧液和复氧液中的LDH释放量。（4）SP对高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。分离新生SD大乳鼠心脏为细胞悬液接种于细胞培养板，分别用正常糖和高糖培养基进行孵育，72h后进行缺氧/复氧处理，细胞随机分为5组，分别为正常对照组，高糖对照组，高糖A/R组，高糖SP+A/R组和高糖SP+D-SP+A/R组。复氧后分别测定细胞凋亡率、缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH释放量。（5）SP对高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧后细胞内钙离子浓度的影响。分离新生SD大乳鼠心脏为细胞悬液接种于细胞培养板，分别用正常糖和高糖培养基进行孵育，72h后进行缺氧/复氧处理，细胞随机分为5组，分别为正常对照组，高糖对照组，高糖A/R组，高糖SP+A/R组和高糖SP+D-SP+A/R组。复氧后用fluo-3AM孵育心肌细胞，随后于激光共聚焦显微镜下检测细胞内钙离子荧光值。结果（1）乳鼠心肌细胞体外培养模型建立成功，经细胞鉴定，心肌细胞占所培养细胞总数的95%以上。缺氧液和缺氧密闭盒中氧分压均＜10mmHg。（2）NK-1受体主要分布于心肌细胞胞质中，在核内也有少量NK-1受体表达。（3）与对照组比较，A/R组的凋亡率明显升高，缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH含量均升高（P﹤0.01）；与A/R组比较，SP+A/R组的凋亡率明显降低，缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH含量均降低（P﹤0.01）；与SP+A/R组比较，SP+D-SP+A/R组的凋亡率明显升高，缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH含量均升高（P﹤0.01）。（4）与正常对照组比较，高糖对照组的凋亡率明显升高，缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH含量均升高（P﹤0.01）；与高糖对照组比较，高糖A/R组的凋亡率明显升高，缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH含量均升高（P﹤0.01）；与高糖A/R组比较，高糖SP+A/R组的凋亡率明显降低，缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH含量均降低（P﹤0.05）；与高糖SP+A/R组比较，高糖SP+D-SP+A/R组的凋亡率明显升高，缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH含量均升高（P﹤0.05）。（5）与正常对照组比较，高糖对照组的细胞内钙离子荧光值无明显变化（P＞0.05）；与高糖对照组比较，高糖A/R组的钙离子荧光值明显升高（P﹤0.01）；与高糖A/R组比较，高糖SP+A/R组的细胞内钙离子荧光值无明显变化（P＞0.05）；与高糖SP+A/R组比较，高糖SP+D-SP+A/R组的细胞内钙离子荧光值无明显变化（P＞0.05）。结论（1）缺氧/复氧可引起心肌细胞损伤，SP预先给药可降低心肌细胞在缺氧/复氧过程中的损伤且该作用可能由NK-1受体介导。（2）高糖孵育可造成心肌细胞损伤，缺氧/复氧可对高糖孵育的大鼠心肌细胞进一步产生损伤，SP预处理可显着减轻该过程中的损伤，且该作用可能由NK-1受体介导（3）高糖孵育并未造成心肌细胞内钙离子浓度的明显升高，缺氧/复氧可造成高糖孵育心肌细胞钙离子浓度的升高，本研究未观察到SP对高糖孵育心肌细胞在缺氧/复氧过程中抑制钙超载方面的明显作用。(本文来源于《山西医科大学》期刊2014-05-28）
欧阳惠碧[5]（2014）在《乌司他丁预先给药对高糖孵育H9c2心肌细胞氧化应激损伤的影响》一文中研究指出研究背景心脏缺血一段时间再恢复血流灌注后,其心肌细胞代谢功能障碍及结构破坏反而加重的现象称为心肌缺血再灌注损伤(]myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI),此现象主要在行体外循环的心脏手术、心肌梗死患者的溶栓治疗和冠心病患者实施非心脏手术中较为多见,其可进一步使心脏的各种危险事件发生率升高。缺血再灌注损伤是一个多因素参与的复杂过程,而机制至今仍未阐明,其中氧自由基的大量产生及心肌细胞凋亡却是造成损伤的重要因素。目前,活性氧(ROS)和氧自由基被认为是导致细胞凋亡的重要因素。在心脏缺血再灌注时产生的氧化应激损伤中,它们对心脏的病理生理改变起到至关重要的作用。因此,如何减少围手术期氧自由基的产生和心肌细胞凋亡的发生是预防心肌缺血再灌注损伤、挽救患者生命的一个重要环节,也是一项重的研究课题。糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种代谢性疾病,主要表现为患者体内的糖代谢和胰岛素分泌异常。糖尿病心脏病是由于患者处于持续高糖状态,心肌细胞过度地受到氧化应激而发生凋亡,最终引起心功能的损伤。不少研究也表明,持续高糖环境时各种细胞凋亡信号通道被激活而诱发心肌细胞的凋亡。围手术期的手术创伤产生的过度应激反应又可增加糖尿病患者围手术期心脏危险事件的发生率,从而增加其致残率和死亡率。乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂,临床上应用广泛,如用于治疗急性胰腺炎、急性循环衰竭、抵抗手术侵袭、改善手术预后、改善重要器官缺血再灌注损伤、器官移植手术、体外循环手术等方面。许多临床及动物实验发现,乌司他丁可能通过改善心功能的损伤,减少氧自由基、炎症介质及细胞的凋亡等机制,从而对缺血再灌注性心肌损伤具有良好的保护作用。但目前关于乌司他丁对心肌缺血再灌注损伤的研究都处于体内研究,未能排除神经和体液的影响,其在离体心肌细胞凋亡方面的影响研究还未见报导。本课题旨在利用过氧化氢(H202)诱导性H9c2细胞氧化应激损伤模型,在细胞水平模拟体内心肌缺血再灌注时产生的氧化应激损伤,并观察乌司他丁对高糖环境下H9c2细胞受到H2O2急性氧化应激诱导的细胞凋亡的影响,并初步探讨其与PI3K/Akt、Erk及Jnk等信号通路的关系。目的①通过对各种指标的检测评估氧化应激过程对H9c2细胞造成的损伤。②评价不同剂量的乌司他丁预先给药对氧化应激损伤后的H9c2细胞有无保护作用,并选择最合适的剂量。③研究乌司他丁预先给药对H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制：其是否具有抗凋亡作用；其是否通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax的表达来减少细胞凋亡；其是否与PI3K/Akt、Erk和Jnk等信号通路有关。④研究乌司他丁预先给药对高糖孵育下心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。方法：1.细胞氧化应激损伤模型制作：于37℃、5%CO2细胞培养孵箱中,加入含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM细胞培养液培养H9c2心肌细胞株。待细胞的生长处于对数生长期时进行实验处理,PBS液洗2次后随机分组。氧化应激组细胞加入含500μmol/L H2O2的低血清DMEM (2%FBS)培养液于孵箱中培养24h,正常对照组细胞只加入低血清DMEM (2%FBS)培养液培养24h,处理结束后收集标本进行各种指标检测。2.分组第一部分分组：细胞于96孔板和6孔板内培养,然后随机分为正常对照组(NC组)、氧化应激模型组(H组)、乌司他丁组(U组)和乌司他丁预先给药组(UH组)。实验时换入2%低血清培养基,NC组换入低血清培养基培养48h；H组前24h低血清培养基培养,后24h换入含500μmol/L H2O2的低血清培养基处理；U组换入含乌司他丁400U/ml低血清培养基培养48h；UH组前24h于含400U/ml乌司他丁的低血清培养基中培养,后24h换入含400U/ml乌司他丁及500μmol/LH202低血清培养基继续培养。各组细胞共48h实验处理后收集标本。第二部分分组：细胞培养于6孔板和T-75培养瓶内,随机分为正常对照组(NC组)、氧化应激模型组(H组)、乌司他丁预先给药组(UH组)、抑制剂+氧化应激组(LYH组或PDH组)和抑制剂+乌司他丁预先给药组(LYUH组或PDUH组)。LY294002和PD9059分别是PI3K/Akt信号通道和Erkl/2信号通道的特异性抑制剂。抑制剂+氧化应激组在前24h加入含10μmol/L抑制剂低血清培养基处理,后24h换入含抑制剂及500μmol/L H2O2低血清培养基中继续培养；抑制剂+乌司他丁预先给药组前24h加入含抑制剂及400U/ml乌司他丁的低血清培养基培养,后24h换入含抑制剂、400U/ml乌司他丁及500μmol/L H2O2低血清培养基中继续培养；其余各组的处理同第一部分。第叁部分分组：细胞培养于96孔板和6孔板内,实验随机分6组：正常糖对照组(NC组)：低糖(5.5mmol/L)低血清(2%FBS)培养基孵育细胞48h；正常糖氧化应激组(H组)：低血清培养基孵育24h后加500μmol/L H2O2继续刺激24h；正常糖乌司他丁预先给药组(UH组)：低血清培养基中加400U/ml UTI孵育24h后再加500μmol/L H2O2继续刺激24h；高糖对照组(HC组)：换入(25mmol/L)高糖低血清培养基,继续孵育48h；高糖+氧化应激组(HH组)：高糖低血清培养基先孵育24h后再加入500μmol/L H2O2继续刺激24h；高糖+UTI+氧化应激组(HUH组)：高糖低血清培养基中加400U/ml UTI孵育24h后再加500μmol/LH202继续刺激24h。各组细胞共实验处理48h后收集标本。3.实验指标及技术(1)显微镜下观察细胞形态于6孔板内培养的心肌细胞经实验处理后,吉姆萨染色后于倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态变化。(2)MTT法测定细胞活力96孔板内心肌细胞实验处理后,每孔换入200μl的低血清培养液和5mg/ml MTT液20μl后继续孵育4h,弃上清,分别再加入150、1DMSO液,轻轻震荡10min后使紫色结晶充分溶解,酶标仪测定各孔波长在490nm(A490)的吸光度(OD值),细胞存活率计算公式：细胞存活率=OD处理组/OD正常组×100%。(3) LDH、SOD、MDA与caspase-3检测实验处理后,收集各组96孔板中培养液,按LDH试剂盒的说明书进行检测及计算。酶消化法收集实验处理后各组6孔板中的细胞标本,BCA法或考马斯蓝法测定各组细胞的蛋白浓度,分别按SOD、MDA与caspase-3试剂盒的说明书进行检测及计算。14)流式细胞仪测定细胞凋亡率实验处理后酶消化法收集细胞及培养液,于常温离心机1000g离心5min,弃上清后PBS液重悬细胞再离心,重复2次,细胞再重悬后调整细胞计数至105个/ml,按Annexin V-FITC/PI双标记法染色处理细胞后于流式细胞仪进行细胞凋亡检测。(5) Western Blot方法测定蛋白表达量实验处理后收集各组细胞标本,酶消化法收集并提取细胞蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取相同蛋白量样品和上样缓冲液调整到相同体积后上样,于10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,湿转法将分离的目的蛋白转印至PVDF膜上,于5%脱脂奶粉中室温封闭1h左右后,对应的一抗40C孵育过夜,洗涤后二抗室温孵育1h, ECL显色,于暗室中X光胶片曝光,预染蛋白Marker确定目的条带。结果1.细胞形态的变化吉姆萨染色后倒置显微镜下观察：NC组细胞生长密度高,呈短梭型紧密生长,边界清楚,贴壁较牢；氧化应激H组细胞生长密度低,细胞间隙增宽,可见大片脱失区,部分细胞收缩变圆,细胞核固缩呈深蓝色,甚至可见细胞碎片；U组形态与NC组相似,而UH组细胞密度较H组高,脱失区面积小,细胞边界较清楚。2.细胞活力的变化氧化应激损伤可使细胞活力显着下降,且随着H202浓度升高,细胞活力逐渐降低。500μmol/L的H2O2浓度用作建立氧化应激模型,其细胞活力较NC组的显着降低,仅为NC组的52.7±0.7%(P=0.00)。乌司他丁与心肌细胞共同孵育下,随着乌司他丁浓度的增加,药物对心肌细胞增殖的抑制作用不断增大,细胞活力逐渐降低。而与H组比较,400U/ml乌司他丁随着预先给药时间的延长,其细胞活力逐渐升高,差异有统计学意义(P=0.00)。与低糖(5mmol/L)组比较,随着糖浓度的增加,心肌细胞存活率逐渐下降,差异有统计学意义(P=0.00),具有浓度依赖性。与HH组比较,HUH组的细胞存活率明显升高(P=0.00)。3. LDH、SOD、MDA、caspase-3与细胞凋亡率的改变与NC组比较,氧化应激损伤可使培养液中LDH活力、细胞内MDA含量、caspase-3表达及细胞凋亡率显着增多,而细胞内SOD活性下降,且差异有统计学意义(P<0.01)。与H组比较,乌司他丁预先给药组培养液中LDH活力、细胞内MDA含量、caspase-3表达及细胞凋亡率都明显降低,细胞内SOD活性升高(P<0.01)。4.高糖环境对心肌细胞氧化应激损伤后MTT、LDH、SOD、MDA及细胞凋亡率的影响与正常糖组比较,高糖环境可造成心肌细胞一定程度的损伤,细胞内SOD活性降低而MDA含量增多(P<0.01),而其他指标的差异无统计学意义；高糖环境下过氧化氢诱导细胞氧化应激可导致明显的细胞损伤,细胞存活率及细胞内SOD活性下降,培养液中LDH活力、细胞内MDA含量及凋亡率增多(P<0.01)。与HH组比较,乌司他丁预先给药组中的培养液LDH活力、细胞内MDA含量及细胞凋亡率都明显降低,而细胞内SOD活性升高(P<0.01)。5.细胞内目的蛋白表达的变化Western结果显示,与NC组比较,H组和UH组的bcl-2表达量显着降低,bax及p-Jnk表达量增多,而总Jnk量无明显差异,bcl-2/bax比值降低而p-Jnk/Jnk比值升高(P<0.01)；与H组比较,UH组的bcl-2/bax比值升高而p-Jnk/Jnk比值降低(P<0.01)。加入PI3K/Akt特异性抑制剂组中,与NC组比较,其余各组的p-Akt的表达量均增多,而总Akt量无明显差异,p-Akt/Akt比值升高(P<0.01),其中HU组的值最大,LYHU组次之,随后是LYH组及H组,组间差异明显(P<0.01)；LYHU组p-Akt/Akt比值较HU组的降低而较H组的升高(P<0.01),故PI3K/Akt抑制剂未能完全阻断乌司他丁引起的作用。加入Erkl/2特异性抑制剂组中,与NC组比较,其余各组的p-Erkl/2的表达量均增多,而总Erkl/2量无明显差异,p-Erk/Erk比值升高(P<0.01),其中HU组的值最大,PDHU组次之,随后是H组及PDH组,组间差异明显(P<0.01)；PDHU组p-Erk/Erk比值较HU组的降低而较H组的升高(P<0.01),故Erkl/2抑制剂也未能完全阻断乌司他丁引起的作用。6.相关性分析相关性分析结果表明,SOD活性与细胞存活率呈正相关,与凋亡率、MDA含量及LDH活性呈负相关；而MDA含量与存活率呈负相关,与凋亡率及LDH活力呈正相关(P<0.01)。结论本实验通过过氧化氢诱导心肌细胞造成氧化应激损伤模型,模拟心肌缺血再灌注后细胞的氧化应激损伤,通过观察细胞形态及测定细胞存活率、抗氧化指标、细胞凋亡率及部分信号传导通路蛋白的变化,得出如下结论：(1)氧化应激对细胞造成明显损伤,引起细胞形态改变,存活率降低,凋亡率增加。(2)乌司他丁预先给药对高糖和正常环境下的心肌细胞氧化应激损伤都有较好的保护作用。(3)高糖环境培养对细胞有损伤作用,乌司他丁预先给药对细胞氧化应激损伤的保护作用主要表现为维持细胞活力,降低细胞凋亡率,提高细胞抗氧化能力。(4)乌司他丁预先给药对氧化应激损伤细胞保护作用的机制：①维持细胞活力,减少细胞内LDH漏出,提高细胞内SOD的活性而减少MDA的含量起到抗氧化作用,减少细胞凋亡率。②增加抗凋亡蛋白bcl-2的表达且减少促凋亡蛋白bax的表达,进而降低caspase-3活性,从而发挥抗细胞凋亡的保护作用。③可通过活化PI3K/Akt及Erkl/2信号通道而抑制Jnk信号通道的活性起保护作用。(本文来源于《南方医科大学》期刊2014-03-01）
刘显庆,姜德谦,罗玉梅,彭振宇,董莉妮[6]（2010）在《脂联素在高糖孵育血管内皮细胞中的表达调节》一文中研究指出目的:探讨脂联素(APN)在高糖孵育血管内皮细胞中的表达调节及意义。方法:用不同浓度葡萄糖(5.5、11、22及33mM)孵育人脐静脉内皮细胞(HUVECs),2天后收集细胞和上清液。用实时荧光定量RT-PCR方法检测细胞中APN、肿瘤坏死因子α(TNFα)和过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)的mRNA表达,用ELISA方法检测细胞上清液中APN和TNFα分泌情况。结果:随培养液中葡萄糖浓度的升高,HUVECs中APN的mRNA表达及上清中APN蛋白含量降低(p<0.05),TNFα的mRNA表达及上清中TNFα蛋白含量增加(p<0.05),HUVECs中PPARγ的mRNA表达降低(p<0.05),且组间比较差异均有统计学意义(p<0.05)。结论:高糖诱导血管内皮细胞保护性细胞因子APN表达分泌下降,可能是高糖诱导的血管内皮细胞功能损害的重要机制之一。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2010年09期）
王婕[7]（2010）在《舒芬太尼预处理对高糖孵育H9c2大鼠成肌细胞缺氧复氧性损伤和凋亡的保护作用及其可能机制》一文中研究指出研究背景心肌低灌注、缺血和复流、再灌注缺伤是非心脏手术围术期引起心脏各种危险事件(Cardiac Risk Events CRE)的最常见原因。缺血再灌注损伤是一种比较复杂且广泛的病理生理过程,心脏恢复过程中发生的心肌缺血再灌注损伤会增加心肌原有的损害和心律失常的发生,严重影响缺血后心脏功能的恢复,对围术期病人的生活质量甚至生命造成巨大的威胁。如何预防和减轻心肌缺血再灌注损伤仍是目前医学界的研究热点。糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病,是直接或间接导致糖尿病患者围术期CIE增加的最主要原因。但是,糖尿病心脏对缺血再灌注损伤的影响尚无定论。诸多研究表明高糖环境可以诱发心肌细胞凋亡。然而,也有动物模型显示高糖环境对缺血诱导的损伤包括凋亡过程中,发挥保护作用。因此,可能高糖环境在正常氧和缺氧情况下对心肌细胞凋亡的影响不同,还需更深一步的研究。舒芬太尼是一种非选择性阿片受体激动剂,在阿片类制剂中舒芬太尼的镇痛效应最强,已经广泛应用于临床麻醉及术后、ICU的镇痛。近年来已有部分临床和动物实验研究显示舒芬太尼对缺血再灌注性心肌损害有很好的保护作用,研究主要在于生化指标及大体心肌的梗死面积,其确切保护机制尚不清楚,且对其在离体心肌及心肌细胞凋亡方面的影响研究还未见报导。本研究拟采用舒芬太尼对缺氧复氧前的细胞进行预处理,研究其对高糖浓度及正常糖浓度孵育下H9c2成肌细胞缺氧复氧引起的细胞凋亡及细胞损伤是否具有保护作用及其作用机制。目的①通过对各种指标的检测评估缺氧复氧过程对H9C2细胞造成的损伤；②综合评价舒芬太尼预处理对缺氧复氧损伤后的H9C2细胞有无保护作用；并研究舒芬太尼预处理对细胞缺氧复氧损伤存在影响的机制；③综合评价舒芬太尼预处理对高糖孵育下缺氧复氧损伤后的H9C2细胞的保护作用；④观察部分指标在正常环境和高糖环境下的异同,探讨高糖培养液对细胞损伤和凋亡的影响。方法1.模型制作采用DMEM含10%FBS细胞培养基培养H9C2心肌细胞株。实验前弃旧培养液,PBS洗2次,然后随机分组。以细胞处于缺氧环境而后进行复氧作为损伤模型,细胞于换液后放入缺氧叁气培养箱中进行缺氧3h(缺氧过程),缺氧培养箱参数为5％CO2、氧气浓度小于2%,其余用氮气平衡,缺氧结束后将各组细胞移入37℃CO2培养箱(复氧过程)培养3h后收集标本进行各种指标检测。正常对照组细胞不需缺氧复氧过程,该组细胞与其余各组同时换液后放入正常细胞培养箱直至与其余各组组一起收集标本。2.分组培养于96孔板或6孔板的细胞随机进行分组。第一部分分组：细胞分为正常对照组(NC组)、缺氧复氧损伤对照组(HR组)、舒芬太尼预处理组(SF组)。根据不同浓度舒芬太尼(1×10-11、10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L),SF组又分为SF11、SF10、SF9、SF8、SF7、SF6组,每组6孔。第二部分分组：包括正常对照组(NC组)、缺氧复氧损伤对照组(HR组)、舒芬太尼预处理组(SF组)、纳洛酮组(NA组),每组为6孔。SF组的培养液中在缺氧前15min加入终浓度为10-9mol/L的舒芬太尼；HR组培养液中加入与SF组舒芬太尼同体积的PBS缓冲液,NA组培养液中含有终浓度为10-9mol/L的舒芬太尼和10-6mol/L的纳洛酮,纳洛酮在舒芬太尼前10min加入培养液中；NC组换入DMEM＋10% FBS培养液后继续入培养箱正常培养,标本收集时间同其余各组。第叁部分分组：包括正常糖组和高糖组。正常糖组包括：正常对照组(NC组)、模型组(HR组)、舒芬太尼预处理组(SF组)、纳洛酮组(NA组)；高糖组包括：高糖对照组(HC组)、高糖模型组(HHR组)、高糖舒芬太尼预处理组(HSF组)高糖纳洛酮组(HNA组)；每组为6孔。正常环境组细胞处理方法同第二部分分组,高糖各组与对应各正常糖组处理方法相同,区别在于高糖组缺氧复氧之前48小时用高糖DMEM液培养细胞,缺氧复氧前亦换入高糖DMED培养液。3.实验方法与技术(1)显微镜下观察细胞状态细胞培养于6孔板中,实验完成后立即在荧光倒置显微镜下观察并拍照记录细胞状态。(2)MTT法测细胞活力细胞计数后以104个/孔接种于96孔板中,培养24h后用于实验,缺氧复氧后每孔加入20μl(5mg/ml)MTT试剂,37℃培养箱继续孵育4h,弃上清加入100μl二甲基亚砜(DMSO),室温摇床30min,酶标仪570nm波长测定OD值。(3)LDH与SOD检测收集实验处理后各组6孔板中培养液,按试剂盒说明进行LDH活力检测和计算。SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法,酶消化法收集6孔板中细胞,400μl PBS重悬,超声波破碎细胞,取悬液严格按试剂盒说明进行SOD活力测定和结果计算。(4) Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡率胰酶消化法(不含EDTA)收集实验结束后的细胞及培养液,1000g离心5min,弃上清PBS重悬并计数,取10万重悬细胞1000g离心5min,弃上清,随后按说明书步骤进行。(5) Western Blot方法实验前考马斯亮蓝法测定蛋白样品浓度,取同相同蛋白量样品上样,12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,湿转法转印到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1h,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育1h,ECL显色,曝光于X光胶片,通过蛋白预染Maker确定目的条带。结果1.细胞状态的变化镜下观察到,NC组细胞分界清晰,细胞核轮廓清楚,核仁明显；HR组细胞分界不清,核轮廓模糊,核仁不明显,可见凋亡小体。视野中大量高折光的漂浮细胞,大部分为死亡,少量为凋亡细胞。SF组细胞状态较NC组稍差,但细胞状态明显优于HR组,高亮细胞明显减少,细胞分界较清楚；NA组细胞则较SF组状态差。说明舒芬太尼预处理对细胞缺氧复氧损伤的保护作用可以被纳洛酮所消弱。2.细胞活力的变化缺氧复氧损伤可使细胞活力显着下降,HR组细胞活力较NC组细胞活力显着降低,HR组细胞活力仅为NC组的53%(P<0.01)；舒芬太尼预处理可使细胞活力明显增加。与HR组比较,从舒芬预处理组SF10组起到SF6组细胞活力升高,且有统计学差异(P<0.05)。舒芬预处理各组细胞活力随舒芬太尼浓度升高而有上升趋势,且自SF9组开始有饱和趋势。纳络酮可消除舒芬太尼预处理维持细胞活力的作用,与SF组比较,NA组细胞活力显着下降(P<0.05)。3.培养液中LDH的变化与NC组比较,HR组和NA组培养液中LDH含量显着增多(P<0.01),与单纯缺氧复氧损伤细胞相比,舒芬太尼预处理可使培养液中LDH含量显着减少(P<0.01)。且舒芬太尼预处理对LDH含量的影响同样有浓度依赖性,自SF9组开始有饱和趋势。4.细胞内SOD含量的变化缺氧复氧可使HR组细胞内SOD活性显着下降(P<0.01),而舒芬太尼预处理可有效阻止SF组细胞SOD活性的减低,但这种保护效应可被纳络酮消除,纳洛酮组细胞内SOD活性与HR组相比差异无统计学意义。5.高糖对细胞缺氧复氧损伤后MTT、LDH及SOD的影响在高糖环境下,细胞通过缺氧复氧后也发生明显的损伤,MTT下降,LDH含量明显升高,SOD活性显着降低；舒芬太尼预处理可以减轻细胞的损伤,这种保护作用同样可以被纳洛酮阻断。但是,高糖环境下细胞的损伤程度却小于正常糖环境下(P<0.05)。细胞的损伤程度即为在正常对照组基础上,模型组细胞的MTT、LDH含量及SOD的变化值占对照组的百分比。舒芬太尼对细胞损伤的保护程度在两种环境下无显着性差异(P>0.05)。舒芬太尼对细胞损伤的保护程度即与模型组相比,舒芬太尼预处理组细胞的MTT下降、LDH含量降低及SOD含量的升高部分占模型组数值的百分比。6.细胞内目的蛋白表达及细胞凋亡率的变化Western结果显示,NC组细胞内Caspase-3 (17KD)未见表达。与NC组相比,HR组cleaved caspase-3 (17KD)蛋白表达量明显增多,而舒芬太尼预处理可使这种蛋白表达量显着少于模型组(P<0.01)；纳络酮可阻断舒芬太尼的这种效应,NA组细胞cleaved caspase-3 (17KD)蛋白表达量与HR组相比无统计学意义(P>0.05)。流式细胞术也发现,舒芬太尼预处理可以减少缺氧复氧引起的细胞的凋亡,舒芬太尼的这些变化可以被纳洛酮所阻断。通过Western blot技术还发现：与NC组相比,HR组p27、p38蛋白表达明显升高(P<0.01), pAkt蛋白的表达明显降低(P<0.01)。与HR组相比,SF组有较高的pAkt蛋白的表达和较低的p27、p38蛋白表达,且均有统计学差异,而且舒芬太尼的这些作用可以被纳洛酮阻断。在对高糖环境对细胞的影响研究中,高糖对照组和正常对照组Caspase-3(17KD)均未见表达。在正常糖组中：与NC组相比,HR组Caspase-3蛋白表达量增加,而SF组与HR组相比Caspase-3蛋白表达量减少。高糖各组趋势与正常组相同。高糖组与正常糖组相比,HHR组比HR组Caspase-3蛋白表达量增多,HSF组比SF组表达量也增多。7.相关分析相关分析结果表明,H9C2细胞活力与培养液上清LDH释放量呈负相关(r=-0.818,P=0.000)。结论本实验通过对细胞造成缺氧复氧损伤模型,模拟心肌缺血再灌注,测定细胞形态、活力,抗氧化指标、凋亡情况及部分信号传导通路的变化得到如下结论：(1)缺氧复氧对细胞造成明显损伤,引起细胞功能改变,凋亡增加。(2)舒芬太尼预处理对高糖和正常环境下的心肌细胞的缺氧复氧损伤都有较好的保护作用；(3)舒芬太尼预处理对细胞缺氧复氧损伤的保护作用有浓度依赖性,且有饱和浓度(浓度≥10-9 mol/L时,从细胞活力和培养液LDH浓度方面可看出保护作用基本达到饱和)(4)在正常糖培养下,高糖对细胞有损伤作用；在缺氧复氧损伤时,高糖对细胞损伤有一定程度的保护作用。(5)舒芬太尼可能通过以下机制起到对缺氧复氧损伤后心肌细胞的保护作用。①提高细胞抗氧化能力,维持细胞活力,稳定细胞膜、减少细胞内LDH的漏出,提高细胞内SOD的活性,减少细胞凋亡；②活化PI3K/Akt通路,发挥抑制细胞凋亡及其它保护作用；③降低丝裂原蛋白激酶p38的活化；④减少细胞周期蛋白p27的表达。(本文来源于《南方医科大学》期刊2010-04-15）
余杰[8]（2010）在《利多卡因预处理对高糖孵育H9c2大鼠成肌细胞缺氧复氧损伤的影响》一文中研究指出研究背景在缺血基础上恢复血流后组织损伤加重,甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)。现已证实,心、脑、肝、肾、肺、胃肠道、肢体及皮肤等多种组织器官都存在缺血再灌注损伤的现象。心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/repeifusion injury, MIRI)为再灌注后缺血的心肌出现舒缩功能降低、心律失常、心肌能量代谢障碍、超微结构的变化和血管无复流等现象。缺血再灌注损伤的发生机制尚未彻底阐明,既往研究证实氧自由基(oxygen free radical, OFR)的作用、白细胞激活、内皮细胞(endothelial cell,EC)功能障碍、细胞内钙超载以及细胞凋亡是引起缺血一再灌注损伤的重要原因。糖尿病(diabetes mellitus, DM)是常见病、多发病,现已明确DM是冠状动脉粥样硬化性心脏病发病的一个重要因素。流行病学资料显示：DM人群中心绞痛、急性心肌梗死(actue myocardial inarction, AMI)、充血性心力衰竭以及严重心律失常等疾病发病率远高于非DM患者,而且当DM患者并发心肌梗死后行药物或手术(包括冠状动脉搭桥和导管介入)治疗,效果均不及非DM患者。人们将这种不良后果归咎于缺血再灌注(ischemia/repeifusion, I/R),这可能与糖尿病患者冠状动脉粥样病变严重而弥漫、内皮功能障碍、储备能力降低所造成的心肌灌注不良有关,另外DM本身的促凝和炎症状态,易形成冠状动脉内微血栓堵塞；DM心肌缺氧应激,NO活性降低,存在冠脉微循环痉挛。而日本的一项多中心研究却显示：急诊经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)住院期间患者病死率与是否患有DM无关,而与血糖增高有关,且发现无DM但伴有高血糖者的死亡率最高,该研究推测这可能与DM性冠心病梗死相关血管(infarct-related artery, IRA)再通后I/R损伤增加有关。基础研究显示DM发生时,心肌组织的结构、功能以及代谢均发生异常,主要表现为：①心肌能量代谢异常,且高糖环境能够直接引起正常心肌细胞功能改变；②细胞内钙调控异常；③微血管病变和微循环障碍,缓激肽释放酶—缓激肽系统在高血糖状态下该系统被抑制；④高血糖时氧化应激增加,信号转导途径改变,激活细胞凋亡。国内外研究证实,DM急性期,NO代偿性合成增加,I/R对DM心肌有保护作用；而DM晚期,由于慢性期NO减少,心肌肥厚,收缩和舒张功能受损,心脏血管周围或间质纤维化, I/R后损伤后将加重心肌损害。近来,心肌缺血再灌注损伤和心肌保护一直是基础研究和临床研究的重点。1986年Murry等首次提出缺血预处理(Ischemia preconditioning, IPC)可以减轻缺血再灌注所致的心肌损伤,随后的一系列研究则发现许多麻醉药物(包括全身麻醉药、阿片类镇痛药以及局部麻醉药)预处理能产生与经典缺血预处理同样的心肌保护作用,这为预处理心肌保护的临床应用开辟了新的途径。利多卡因在急性心梗、恶性心律失常等引起的工R损伤治疗中具有较好的效果。有关预防性应用利多卡因的临床有效性和安全性一直备受争议。既往的荟萃分析(meta-analysis)表明预防性应用利多卡因虽然可减少急性心肌梗死患者心室纤颤的发生,但却增加了患者的死亡率。然而,一项多国家多中心观察研究表明：预防性应用利多卡因并不增加急性心肌梗死患者的死亡率,预防性应用利多卡因也许是无害的。总而言之,关于利多卡因预处理在心肌缺血再灌注损伤防治中的作用目前尚不明了,更不能确定利多卡因预处理心肌保护效应的具体作用机制。目的本研究通过在体外细胞水平以缺氧复氧处理H9c2大鼠成肌细胞建立心肌缺血再灌注损伤模型,初步探讨：①不同梯度浓度利多卡因预处理对缺氧复氧引起的心肌细胞损伤是否具有保护作用；②利多卡因预处理对缺氧复氧引起的H9c2心肌细胞凋亡的影响及其可能机制。③利多卡因预处理对高糖孵育下H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤是否具有保护作用及与高糖孵育的关系。’方法第一部分：研究不同浓度利多卡因预处理对H9c2大鼠成肌细胞缺氧复氧损伤的影响。实验随机分为7组：正常对照组(NC组)、缺氧复氧损伤对照组(HR组)；利多卡因预处理组(LP组),根据利多卡因的不同浓度对分为LP1(1μmol/L)、LP2(2.5μmol/L)、LP3(5μmol/L)、LP4(10μmol/L)、LP5(20μmol/L)组,每组6孔。心肌细胞损伤程度以心肌细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)活性来表示,同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。第二部分：研究利多卡因预处理对H9c2大鼠成肌细胞缺氧复氧损伤后caspase-3活性、钙超载的影响。实验随机分为3组：①正常对照组(NC组)；②缺氧复氧组(H/R组)；③利多卡因预处理组(LPC组)。心肌细胞损伤程度以心肌细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)活性来表示。用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。通过免疫细胞化学技术检测心肌细胞胞浆caspase-3的表达。荧光分光光度法检测细胞内钙离子浓度。第叁部分：研究利多卡因预处理对高糖孵育下H9c2心肌细胞缺氧复氧性损伤是否具有保护作用。实验随机分为二组,即正常糖浓度组(N组)和高糖浓度组(H组),每组又分为正常对照组(NC组和HC组)、缺氧复氧损伤组(NHR组和HHR组)和利多卡因预处理组(NLP组和HLP组)。心肌细胞损伤程度以H9c2细胞活力和培养基中乳酸脱氢酶(LDH)释放量来表示,同时检测H9c2细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果第一部分：与NC组比较,HR组细胞活力显着减弱,LDH释放量显着增加,并且MDA含量增多,SOD活性降低；与HR组比较,L2-5组细胞活力显着增强,LDH释放量显着降低；并且MDA含量下降,SOD活性增强；且Pearson积差相关分析显示,细胞活力强弱的变化与LDH释放量(r=-0.870,P=0.000)、MDA含量(r=-0.924,P=0.000)呈负相关,与SOD活性呈正相关(r=0.894,P=0.000)。细胞活力的增强与利多卡因浓度的增加呈正相关(r=0.976,P=0.001),与LDH释放量(r=-0.912,P=0.011)和MDA含量(r=-0.969,P=0.001)呈负相关。第二部分：与NC组比较,缺氧复氧处理细胞后可使其LDH释放量显着增高(P<0.01),细胞活力明显下降(P<0.01),流式细胞仪检测到大量心肌细胞凋亡,凋亡率为20.12±2.19%。利多卡因预处理细胞可显着提高心肌细胞活力(P<0.01),降低LDH释放量和细胞凋亡率(P<0.01)。免疫细胞化学技术检测结果表明,缺氧复氧损伤后心肌细胞中caspase-3活性增强；而利多卡因预处理则可降低caspase-3活性。荧光风光光度法检测显示,缺氧复氧损伤后细胞内钙离子浓度显着升高；而利多卡因预处理则可降低细胞内钙离子浓度。第叁部分：①N组：缺氧复氧后细胞LDH释放量、MDA含量较NC组显着增多,细胞活力、SOD活性显着减弱。缺氧前利多卡因预处理细胞后,其细胞MDA含量较NHR组显着减少,SOD活性显着增强(P均<0.01)；②H组：缺氧复氧后,与HC组比较,其LDH释放量、MDA含量显着增多,而细胞活力、SOD活性显着降低；而利多卡因预处理细胞后,与HHR组比较,其LDH释放量、MDA含量显着减少,细胞活力、SOD活性显着增高(P均<0.01)。③与N组比较：高糖孵育心肌细胞后其LDH释放量、MDA含量较NC组显着增多,而细胞活力、SOD活性则显着降低(P均<0.01)。④高糖与实验处理(分组)两因素的交互效应均具有显着统计学意义(P均<0.01)。结论(1)本研究浓度范围内的利多卡因能减轻心肌细胞的缺氧复氧损伤,并呈浓度依赖性；其机制可能与利多卡因的抗自由基作用、离子通道阻滞功能以及抗凋亡作用有关。(2)缺氧前给予浓度为10μmol/L的利多卡因能够增强H9c2心肌细胞耐受缺氧复氧性氧化损伤的能力,同时抑制缺氧复氧过程中的细胞凋亡,可能与抑制细胞caspase-3活性、钙超载有关。(3)高糖本身能导致心肌细胞的氧化应激损伤,随后的缺氧复氧则加剧了氧化损伤；一定浓度(10μmol/L)的利多卡因可能是通过抑制活性氧自由基的膜脂质过氧化作用来减轻心肌细胞的缺氧复氧性损伤。缺氧条件下,高糖能以糖酵解的能量代谢途径在一定程度上减轻细胞的缺氧复氧损伤。(本文来源于《南方医科大学》期刊2010-04-15）
高糖孵育论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)后处理对低糖/高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响,并探讨CGRP的保护机制。方法:1.心肌细胞培养、鉴定方法及建立H/R模型。选取健康出生72小时以内的SD大鼠,取出并剪碎心脏,Ⅱ型胶原酶反复消化数次,离心后取上清接种于六孔细胞培养板培养72小时。对心肌细胞特有的横纹肌肌动蛋白使用免疫组化SABC法对心肌细胞进行鉴定。培养72小时后,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,缺氧/复氧结束之后使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率。2.CGRP对乳鼠心肌细胞H/R损伤的影响。将培养72小时的心肌细胞选取12孔细胞进行实验并随机分成四组(n=3):(1)对照组:不处理不加药;(2)H/R组:更换缺氧液缺氧3小时,更换DMEM复氧2小时;(3)H/R+CGRP组:更换缺氧液缺氧3小时,更换含有10-8mmol/L CGRP的DMEM,复氧2小时;(4)H/R+CGRP+CGRP8-37组:提前1小时更换含有10-7mmol/L的CGRP8-37的DMEM,更换缺氧液缺氧3小时,更换含有10-8mmol/L的CGRP的DMEM,复氧2小时。将四组心肌细胞按照以上方法处理后,使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率;收集上清液,ELISA法测定各孔心肌细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的浓度。3.CGRP对原代培养乳鼠心肌细胞H/R损伤保护的机制。按照方法2进行分组及处理,使用JC-1测定心肌细胞线粒体膜电位(MMP)变化,使用Fluo-3 AM和Rhod-2AM分别测定细胞内及线粒体内的钙浓度,使用DCFH-DA测定细胞内的活性氧浓度。4.CGRP对高糖孵育心肌细胞H/R损伤的影响。心肌细胞分别用低糖DMEM及高糖DMEM孵育,将培养72小时的心肌细胞选取15孔进行实验并随机分成5组(n=3):(1)低糖对照组(LG):心肌细胞全程使用低糖DMEM孵育,不进行缺氧/复氧的处理,不更换缺氧液,也不添加任何药物的干预;(2)高糖对照组(HG):心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,不进行缺氧/复氧的处理,不更换缺氧液,也不添加任何药物的干预;(3)高糖缺氧/复氧组(HG+H/R):心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,不添加任何药物的干预;(4)HG+H/R+CGRP组:心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,心肌细胞缺氧3小时复氧2小时,在缺氧结束后复氧开始前更换DMEM时加入CGRP(10-8mmol/L);(5)HG+H/R+CGRP+CGRP8-37组:心肌细胞全程使用高糖DMEM孵育,提前1小时加入CGRP8-37(10-7mmol/L),缺氧3小时,更换DMEM时加CGRP(10-8mmol/L)复氧2小时。将五组心肌细胞按照以上方法处理后,使用TUNEL法测定各孔心肌细胞的凋亡率;收集上清液,ELISA法测定各孔心肌细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的浓度。5.CGRP对高糖孵育乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤保护的机制。按照方法4进行分组及处理,使用Fluo-3 AM和Rhod-2 AM分别测定细胞内及线粒体内的钙浓度,使用DCFH-DA测定细胞内的活性氧浓度。结果:1.心肌细胞培养成功,在显微镜下观察、拍照并计数,所需心肌细胞的数量占所有细胞数量总和的90%以上。2.成功建立H/R损伤,凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。3.H/R组心肌细胞凋亡率、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度、培养基中LDH和caspase-3的浓度比对照组明显升高(P<0.05),MMP明显下降(P<0.05);通过与H/R组的对比,观察H/R+CGRP组心肌细胞的凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内的活性氧浓度、细胞内及线粒体内的钙浓度均明显下降(P<0.05),MMP明显升高(P<0.05);并且CGRP的特异性拮抗剂CGRP8-37可以逆转CGRP对缺氧/复氧心肌细胞的作用。4.与LG组比较,HG组心肌细胞凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞内及线粒体内的钙浓度均明显升高(P<0.05);与HG组比较,HG+H/R组心肌细胞凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度均明显升高(P<0.05);与HG+H/R组比较,HG+H/R+CGRP组心肌细胞的凋亡率、培养基中LDH和caspase-3的浓度、细胞内活性氧浓度、细胞及线粒体内的钙浓度均明显下降(P<0.05);并且CGRP的特异性拮抗剂CGRP8-37可以逆转CGRP对缺氧/复氧心肌细胞的作用。结论:1.心肌细胞经过H/R处理后导致细胞损伤,CGRP后处理可以减轻H/R对心肌细胞的损伤,CGRP8-37可以逆转CGRP的作用。2.高糖DMEM孵育对心肌细胞造成了损伤,缺氧/复氧可以加重高糖孵育心肌细胞的损伤,CGRP后处理可以减轻高糖孵育心肌细胞的缺氧/复氧损伤,CGRP8-37可以逆转这种保护作用。3.CGRP发挥心肌保护作用的机制与其升高MMP、降低细胞内及线粒体内钙浓度和细胞内活性氧浓度有关。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
高糖孵育论文参考文献
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