呕吐毒素脱毒型枯草芽胞杆菌的筛选及初步研究应用

论文摘要

呕吐毒素（vomitoxin,VX）属于B组单端孢霉烯族毒素,化学名称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）,是现已发现的霉菌毒素中检出率最高,被检出含量最高的霉菌毒素。有报道称,呕吐毒素是对动物生产造成危害最大的毒素之一,目前我国对呕吐毒素脱毒的方法多为物理处理,但因吸附毒素的同时还会吸附营养物质而未被广泛适用。近年来,益生性枯草芽胞杆菌多次被报道具有良好脱毒的效果而且还能发挥其自身益生性能,即在动物体内稳定脱毒的同时又能增强机体的肠道功能,保护肠道健康,现已成为极具发展潜力的霉菌毒素脱毒制剂。本研究从来源于动物肠道及粪便的益生菌菌株中成功筛选出兼备脱毒功能及益生性能的枯草芽胞杆菌菌株,并对其脱毒特性进行了初步研究,对其体内外脱毒效果进行验证,为研发脱毒型动物微生态制剂提供理论与技术支撑。1、益生菌菌株的筛选及鉴定以DON的类似物苯基环氧乙烷作为唯一碳元素来源对实验室益生菌菌株进行初筛,初步筛选出可在DON环境下存活的菌株6株;再以纯品DON为底物,通过脱毒复筛,选出对纯品DON脱毒效果最好的菌株WXBs-042;对筛选出的菌株进行鉴定,通过形态学观察、生化指标鉴定、16S rRNA gene鉴定、系统发育分析后,确定WXBs-042为枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）。2、枯草芽胞杆菌WXBs-042生物学特性的研究生长曲线结果表明,枯草芽胞杆菌WXBs-042在2h左右进入对数生长期,对数期为4h左右随后进入稳定期、衰退期。在抑菌性能方面,枯草芽胞杆菌WXBs-042 对沙门氏菌、大肠杆菌 K88、K99、0139、0157 有一定的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌无抑菌活性。菌株耐受性结果表明,枯草芽胞杆菌WXBs-042能耐受高温、模拟胃液及0.3%胆盐等条件。3、枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒特性的研究枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒特性的研究结果表明,枯草芽胞杆菌WXBs-042对DON的脱毒效果与作用时间呈正相关关系;枯草芽胞杆菌WXBs-042对DON的脱毒效果与脱毒环境的pH无关;枯草芽胞杆菌WXBs-042发酵液不同处理组对DON的脱毒效果不同,其中发酵灭活菌处理组脱毒效果最好,脱毒率达72.16%;针对菌体-DON复合物稳定性的评价试验,证明该复合物稳定性良好。初步判定枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒方式为少量发酵上清降解脱毒及菌体吸附脱毒的双重作用。4、动物试验效果验证动物试验方案:空白对照组、阴性对照组、益生菌组、攻毒组、混合组、预防Ⅰ组、预防Ⅱ组及治疗组。采用集中按时灌胃的方式进行DON及益生菌的灌胃,分别在试验第14d和第28d集中剖检采样,分析各组BALB/c小鼠的生产性能、血清生化指标、观察肝脏及空肠切片的变化,分析WXBs-042在动物体内脱毒的效果及其益生的作用。1.各组BALB/c小鼠的生产性能结果表明,灌服WXBs-042能显著提高未灌胃DON的BALB/c小鼠的体重和平均日增重（P<0.05）,提高BALB/c小鼠的生产性能;DON攻毒显著降低小鼠体重、平均日增重（P<0.05）;灌服WXBs-042菌悬液能缓解DON中毒对BALB/c小鼠体重、平均日增重的影响（P<0.05）。2.血清生化指标结果表明,益生菌组BALB/c小鼠的血清生化指标与空白、阴性对照组相比无显著差异（P>0.05）;DON攻毒组BALB/c小鼠的血清生化指标中ALT、AST指标显著高于各对照组（P<0.05）,而WXBs-042的添加可以显著缓解中毒现象（P<0.05）。3.通过对肝脏制作病理切片并观察,发现WXBs-042菌株的灌胃不会对BALB/c小鼠的肝脏组织结构造成损伤;DON破坏BALB/c小鼠肝脏组织结构,导致炎性细胞浸润、肝细胞破裂溶解等病理学变化,WXBs-042菌株的加入能缓解该现象。4.空肠病理切片观察发现,DON破坏BALB/c小鼠空肠绒毛组织结构,可见上皮细胞脱落及肠绒毛变短等现象,WXBs-042菌株的灌胃会促进空肠绒毛生长同时缓解其它攻毒DON试验组空肠绒毛被破坏现象的发生。以上结果表明,WXBs-042既可以发挥益生作用,提高BALB/c小鼠的生产性能;又可以在动物体内发挥脱毒作用,有效缓解DON对BALB/c小鼠造成的损伤,同时预防Ⅱ组是最佳预防方式。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 前言
•   1.1 益生菌简介
•     1.1.1 益生菌的概念及筛选标准
•     1.1.2 益生菌的生理作用及其作用机制
•       1.1.2.1 直接及间接营养作用
•       1.1.2.2 改善肠道的作用
•       1.1.2.3 免疫功能的调节作用
•     1.1.3 动物益生性芽胞杆菌
•       1.1.3.1 生物夺氧
•       1.1.3.2 拮抗致病菌
•       1.1.3.3 增强动物机体的免疫功能
•     1.1.4 益生性枯草芽胞杆菌降解有毒物质的研究与应用
•   1.2 呕吐毒素的概述
•     1.2.1 DON的概念
•     1.2.2 DON的危害
•       1.2.2.1 慢性及急性毒性
•       1.2.2.2 细胞毒性
•       1.2.2.3 免疫毒性
•       1.2.2.4 三致作用（致癌、致畸、致突变）
•     1.2.3 DON的污染概况
•     1.2.4 DON的限量标准
•     1.2.5 DON的微生物脱毒研究进展
• 2 本研究的目的与意义
• 3 材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 主要仪器设备
•     3.1.2 主要试剂和材料
•     3.1.3 主要溶液的配制
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 脱毒菌株的初筛
•     3.2.2 脱毒菌株的复筛
•     3.2.3 脱毒菌株的鉴定
•       3.2.3.1 脱毒菌株的形态学观察
•       3.2.3.2 脱毒菌株的生理生化鉴定
•       3.2.3.3 脱毒菌株的16S rRNA gene扩增测序鉴定
•     3.2.4 脱毒菌株的生物学特性
•       3.2.4.1 脱毒菌株生长曲线的测定
•       3.2.4.2 脱毒菌株抑菌性能的测定
•       3.2.4.3 脱毒菌株耐受性能的测定
•     3.2.5 脱毒菌株的脱毒特性研究
•       3.2.5.1 不同时间点对脱毒率的影响
•       3.2.5.2 不同pH对脱毒率的影响
•       3.2.5.3 不同组份对脱毒率的影响
•       3.2.5.4 菌体-DON复合物稳定性的评估
•     3.2.6 动物试验
•       3.2.6.1 试验动物及分组
•       3.2.6.2 饲养管理
•       3.2.6.3 测定指标和方法
•     3.2.7 统计学分析
• 4 结果与分析
•   4.1 脱毒菌株的初筛和复筛结果
•   4.2 脱毒优势菌株的鉴定结果
•     4.2.1 菌株WXBs-042的形态学及显微镜观察结果
•     4.2.2 菌株WXBs-042的生理生化鉴定结果
•     4.2.3 菌株WXBs-042的16S rRNA gene扩增及测序结果
•     4.2.4 菌株WXBs-042系统发育分析
•   4.3 枯草芽胞杆菌WXBs-042的生物学特性
•     4.3.1 枯草芽胞杆菌WXBs-042的生长曲线
•     4.3.2 枯草芽胞杆菌WXBs-042的抑菌效果
•     4.3.3 不同温度对枯草芽胞杆菌WXBs-042存活率的影响
•     4.3.4 模拟胃液及0.3%胆盐对枯草芽胞杆菌WXBs-042存活率的影响
•   4.4 枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒特性的研究结果
•     4.4.1 不同时间点对菌株WXBs-042脱毒率的影响
•     4.4.2 不同pH条件对菌株WXBs-042脱毒率的影响
•     4.4.3 不同发酵液处理组对菌株WXBs-042脱毒率的影响
•     4.4.4 菌株WXBs-042菌体-DON稳定性的评估结果
•   4.5 动物试验验证结果
•     4.5.1 各处理组BALB/c小鼠生长性能的结果
•     4.5.2 各处理组BALB/c小鼠脏器指数的结果
•     4.5.3 各处理组BALB/c小鼠血清生化指标的结果
•     4.5.4 各处理组BALB/c小鼠肝脏切片观察
•     4.5.5 各处理组BALB/c小鼠不同肠段切片观察结果
• 5 讨论
•   5.1 脱毒菌株的初筛及复筛
•   5.2 脱毒优势菌株的鉴定
•   5.3 枯草芽胞杆菌WXBs-042的生物学特性
•   5.4 枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒特性研究
•     5.4.1 不同作用时间对枯草芽胞杆菌WXBs-042脱除DON的影响
•     5.4.2 不同pH值对枯草芽胞杆菌WXBs-042脱除DON的影响
•     5.4.3 不同发酵处理组对枯草芽胞杆菌WXBs-042脱除DON的影响
•     5.4.4 菌株WXBs-042菌体-DON复合物的稳定性
•   5.5 动物试验验证枯草芽胞杆菌WXBs-042对灌胃DON的BALB/c小鼠的解毒作用
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 翟志雯

导师: 王喜亮

关键词: 益生菌,呕吐毒素,枯草芽胞杆菌,吸附脱毒

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

基金: 国家重点研发计划“动物疫病生物防治性制剂研制与产业化项目”(No.2017YFD0501000)

分类号: S852.6

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000842

总页数: 68

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