嗜酸性氧化亚铁硫杆菌启动子筛选和亚铁氧化基因敲除株转录组分析

论文摘要

生物冶金技术是利用自然界的微生物对矿石进行生物氧化,在其自身的代谢作用下加速矿石中的金属矿物转化成金属氧化物的技术,又称为生物浸出技术。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans,简称A.ferrooxidans）是生物冶金中的优势菌种,是一种重要的冶金工业微生物。该菌既能以亚铁离子作为唯一生长能源,又能以单质硫或还原性无机硫化物获得能量和还原力用于自身的代谢,其能量代谢途径具有多样性和复杂性。深入探究该菌的遗传背景及其能量代谢系统,不仅能在理论上阐明亚铁代谢和硫代谢的关系,也能促进该菌在生物冶金中的利用效率。关于A.ferrooxidans的亚铁氧化代谢机制尚不明确,由Bonnefoy等人基于模式菌株A.ferrooxidans ATCC 23270提出的亚铁氧化电子传递模型,目前在国际上被普遍接受。基于该亚铁氧化电子传递模型,Cyc2是唯一的第一个电子受体蛋白,实验室前期敲除了cyc2基因及其替代基因AFE1428,并没有阻断亚铁氧化能力。在此基础上,为了提高A.ferrooxidans的亚铁氧化效率,本文从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌高效启动子的筛选和亚铁氧化相关基因敲除突变株的转录组学分析两个方面展开研究,进行了以下工作。将A.ferrooxidans的转录组测序数据,进行生物信息学分析预测,在全基因组范围内寻找可能的高效启动子序列,重点分析亚铁代谢相关基因的转录调控元件和启动子活性,为在A.ferrooxidans中基因的高效表达提供备选的启动子序列。将生物信息学预测的11个转录水平较高基因的启动子分别与报告基因gusA连接,在大肠杆菌中异源表达检测启动子活性。11个检测的A.ferrooxidans启动子在大肠杆菌中的活性6个比Ptac强,2个比Ptac弱一些,依次为P0781>P2727>P1658>P2254>P2026>P2278>Ptac>P0422>P2998,剩下3个（P0041、P0696和P1636）启动子的活性非常低,尚待确认。进一步将这三个启动子和两个有活性的启动子（P2026和P2998）一起在A.ferrooxidans中检测活性,结果是1个比Ptac强,2个比Ptac弱一些,依次为P2026>Ptac>P2998>P0041,P0041在A.ferrooxidans中具有明显的启动子活性,但是P0696和P1636这两个启动子同样几乎没有活性,启动子检测结果与在大肠杆菌中相似,分析这些转录活性较高基因启动子的活性有较大差异的原因可能是因为启动子受不同程度的表达调控和启动子预测软件的准确率问题等。高效启动子的获得,有利于构建亚铁氧化代谢能力提高的浸矿工程菌。为进一步研究嗜酸性氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化关键基因cyc2、AFE1428的功能及其他功能替代基因,以实验室在前期工作中获得的A.ferrooxidans基因敲除突变株△cyc2、△AFE1428和△cyc2-△AFE1428为实验材料,以AA ferrooxidans ATCC 23270野生型为对照,通过检测分别以亚铁和硫粉为能源培养时的生长和亚铁氧化,分析确定了收集菌体的培养时期,准备样品进行了转录组测序。通过分析比较各敲除突变菌株与野生型菌株在以亚铁为能源培养条件下相关基因的表达变化,找出了显著差异表达的基因,进一步对这些基因进行了Pathway和GO功能分析,并用RT-qPCR方法检测了A.ferrooxidans 亚铁氧化代谢相关基因和以上显著差异表达的基因的表达量,验证了转录组数据的可靠性。最后,根据转录组数据、RT-qPCR结果和生物信息学预测,分析了cyc2、AFE1428和几个显著差异表达基因在A.ferrooxidans亚铁氧化代谢中的功能,可通过下一步实验进一步验证。综上,A.ferrooxidans高效启动子的获得和亚铁氧化相关基因敲除突变株的转录组测序及数据分析,为进一步研究该菌的亚铁氧化电子传递模型以及其他亚铁氧化电子关键传递体蛋白提供了思路和数据支持。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 研究背景综述
•   1.1 生物冶金介绍
•   1.2 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌简介
•   1.3 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的代谢系统
•     1.3.1 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的硫氧化代谢系统
•     1.3.2 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的亚铁氧化代谢系统
•   1.4 启动子
•     1.4.1 启动子活性报告基因
•     1.4.2 高效启动子的筛选
•   1.5 本文的研究目的和研究内容
• 第二章 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌高效启动子的预测与验证
•   2.1 方法和材料
•     2.1.1 生物信息学软件
•     2.1.2 菌株和质粒
•     2.1.3 培养基和培养条件
•     2.1.4 试剂和仪器
•     2.1.5 本章实验所用引物
•     2.1.6 常用的PCR扩增反应体系
•     2.1.7 限制性核酸内切酶反应体系
•     2.1.8 常用的连接反应体系
•     2.1.9 常规分子生物学实验操作
•     2.1.10 GusA酶活的测定
•   2.2 实验结果与讨论
•     2.2.1 A.ferrooxidans ATCC 23270基因组高效启动子预测及序列分析
•     2.2.2 A.ferrooxidans ATCC 23270基因组高效启动子序列的特征分析
•     2.2.3 启动子的验证
•   2.3 本章小结
• 第三章 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化相关基因敲除突变菌株的转录组测序
•   3.1 方法与材料
•     3.1.1 菌株
•     3.1.2 培养基和培养条件
•     3.1.3 试剂和仪器
•     3.1.4 本章实验所用引物
•     3.1.5 实验操作
•     3.1.6 转录组测序样品准备
•     3.1.7 转录组测序
•   3.2 结果与讨论
• 1428和△cyc2-△AFE₁428的检测'>    3.2.1 A.ferrooxidans敲除株△cyc2、△AFE₁428和△cyc2-△AFE₁428的检测
•     3.2.2 以亚铁为能源时A.ferrooxidans生长曲线的测定
•     3.2.3 转录组测序质量检测
•     3.2.4 以亚铁为能源时A.ferrooxidans亚铁氧化曲线的测定
•     3.2.5 以硫粉为能源时A.ferrooxidans生长曲线的测定
•   3.3 本章小结
• 第四章 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化相关基因敲除突变菌株的转录组学分析
•   4.1 方法与材料
•     4.1.1 菌株
•     4.1.2 培养基和培养条件
•     4.1.3 试剂和仪器
•     4.1.4 本章实验所用引物
•     4.1.5 实验操作
•   4.2 结果与讨论
•     4.2.1 转录组测序结果的基因表达水平分析
•     4.2.2 转录组测序结果的差异表达基因分析
•     4.2.3 转录组测序结果的显著差异表达基因Pathway分析
•     4.2.4 转录组测序结果的显著差异表达基因GO功能分析
•     4.2.5 转录组测序结果的qPCR检测及分析
•   4.3 本章小结
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭玉晓

导师: 刘相梅

关键词: 嗜酸性氧化亚铁硫杆菌,亚铁氧化电子传递模型,启动子,转录组学,生物信息学,基因敲除突变株

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,冶金工业

单位: 山东大学

基金: 国家自然科学基金(31370084,31570041)

分类号: TF18;Q78

总页数: 90

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