张建业1唐思丽1张玲玲2黄文菁1林敏婷1王声1孙明娜1刘韵1
（1广州医科大学药学院广东广州511436）
（2广州医科大学附属第五医院广州广东511436）
【摘要】目的：本研究旨在应用LC/MS/MS鉴定Caco-2细胞中吴茱萸次碱的代谢产物，推测其代谢途径。方法：在Caco-2细胞中加入100μM吴茱萸次碱处理3h、6h、12h，其后收集并纯化样品，LC/MS/MS分析鉴定代谢产物。结果：吴茱萸次碱的代谢产物是单羟基化吴茱萸次碱M1。结论：LC/MS/MS灵敏、操作简单，可快速鉴定Caco-2细胞中的吴茱萸次碱的代谢产物。
【关键词】LC/MS/MS；Caco-2细胞；吴茱萸次碱；代谢产物
【中图分类号】R44【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）13-0387-02
吴茱萸次碱是从中药吴茱萸中提取出来的生物碱，是吴茱萸的主要有效成分，吴茱萸次碱的结构如图1。药物代谢过程是影响药物发挥作用及产生活性或毒性的过程，充分了解药物的代谢途径及由之产生的代谢产物，有助于揭示药物发挥作用或产生毒性的过程，并引导药物的合理使用和新药的临床开发[1]。
Caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞，表达包括P450在内的代谢酶，可用于研究药物的代谢[2]。本研究利用LC/MS/MS鉴定Caco-2细胞中吴茱萸次碱的代谢产物，为进一步研究吴茱萸次碱的代谢特点提供依据。
图1吴茱萸次碱结构图
1.仪器与材料
超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（UPLC-QTOF-MS，G6540A，安捷伦科技有限公司）。色谱柱：BEHC18（1.8μm,2.1×100mm），VanGuardBEHC18（1.7μm,2.1×5mm）；质谱元件：MSQ-TOF。LC-MS分析软件：QualitativeAnalysisB.06.00。所用有机溶剂为RCILab-scan的色谱纯或分析纯。
吴茱萸次碱（批号：20130713）标准品购于天津马克生物技术有限公司，甲醇制备成0.1mg/mL的储备液，4℃储存。
2.方法与结果
2.1样品纯化与制备
取对数生长期的Caco-2细胞接种至6孔板，用含10%胎牛血清的RMPI-1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养，待各孔细胞密度达80%，更换培养基，加入吴茱萸次碱，使最终浓度为100μM，孵育3h、6h、12h。孵育结束后，用预冷的PBS洗涤细胞，经反复冻融和超声，以甲醇混悬细胞，然后15000r/min离心20min，取上清注入UPLC-QTOF-MS联用仪进行分析。
2.2代谢产物的定性分析
代谢产物在代谢后保有原型药物的基本结构，因此，代谢产物的结构鉴定可在原型药物质谱裂解规律的基础上进行[3]。通过LC/MS/MS可获取得到一级质谱图的分子离子信息和二级质谱图的碎片离子信息，将获取到的质谱信息与原型药的信息进行比较，并结合相关参考文献，可对代谢产物进行结构鉴定。由于药物处理Caco-2细胞12h后代谢更完全，故本研究选择12h实验组进行代谢产物的定性分析。
2.2.1吴茱萸次碱的代谢产物吴茱萸次碱原药的保留时间为17.6690min，准分子离子m/z为288.1156，MS/MS主要碎片离子是271.0875、260.1164、243.0912，与文献报道的相符[4]。将实验组样品与空白对照组样品对比，从吴茱萸次碱实验组中提取得到1个有别于空白对照组的提取离子色谱图，物质的出峰时间分别为19.4480min，命名为M1。其中，代谢产物M1准分子离子m/z为304.2979，与吴茱萸次碱m/z288.1156相比，大16，推测M1是吴茱萸次碱的羟基化化合物。二级质谱图碎片离子m/z158.0530和m/z146.9785可以推测出羟基化位于C环上，并结合相关参考文献[4]，可确定代谢产物M1的结构如图3。图2（A）为吴茱萸次碱M0的m/z288的提取离子色谱图，图2（B）为吴茱萸次碱代谢产物M1的m/z304的提取离子色谱图，代谢后原药M0和代谢产物M1的准分子离子信息及碎片离子信息见表1，吴茱萸次碱的代谢产物M1的结构见图3，吴茱萸次碱代谢产物M1的质谱裂解规律见图4。
表1吴茱萸次碱及其代谢物的质谱结果
M0：实验得到的吴茱萸次碱；M1：吴茱萸次碱代谢产物
——：暂无数据
图2吴茱萸次碱及其代谢产物m/z288(A)、304(B)的提取离子色谱图
图3吴茱萸次碱代谢产物M1结构图
图4吴茱萸次碱代谢产物M1的质谱裂解规律图
3.讨论
将实验组样品与空白对照组样品对比，从吴茱萸次碱实验组中得到一个代谢产物，通过LC/MS/MS获取得到的一级质谱图的分子离子信息和二级质谱图的碎片离子信息，可以确定吴茱萸次碱代谢产物M1的[M+H]+为304，比吴茱萸次碱大16，是吴茱萸次碱的羟基化化合物，根据二级质谱图碎片离子m/z158.0530和m/z146.9785可以推测出羟基化位于C环上（见图3）。这与SangKyuLee等人[4-5]鉴定出来的在脂肪环部分发生羟基化的代谢产物是一致的。
致谢：本文受广州市属高校科研项目1201410039的资助。
【参考文献】
[1]李艺，蒋建东.中国药用天然产物有效成分的代谢研究进展[J].中国中药杂志，2010,35（23）：p.3223-3232。
[2]HeinZ,etal.ThedualroleofannexinIIintargetingofbrushborderproteinsandinintestinalcellpolarity[J].Differentiation,2011,81(4):p.243-252.
[3]丛浦珠，李笋玉．天然有机质谱学[M]．北京：中国医药科技出版社，2002：p.225
[4]SangKyuLee,etal.Characterizationofinvitrometabolitesofrutaecarpineinratlivermicrosomesusingliquidchromatography/tandemmassspectrometry.RapidCornrnun.MassSpectrorn.2004.18:p.1073-1080.
[5]SangKyuLee,etal.CharacterizationofthePhaseIImetabolitesofrutaecarpineinratbyliquidchromatographyelectrosprayionization-tandemmassspectrometry.Xenobiotiea.2005.35(12):p.1135-1145．