基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

论文摘要

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 供试材料
•   1.2 海岛棉编辑载体构建
•     1.2.1 基础载体构建
•     1.2.2 编辑载体组装
•   1.3 海岛棉原生质体制备及转化
•     1.3.1 富集编辑载体核心片段
•     1.3.2 原生质体的制备与转化
•   1.4 内源靶基因编辑效应检测
•   1.5 脱靶效率分析
•   1.6 sgRNA及其Cas9表达分析
• 2 结果与分析
•   2.1 编辑载体的构建
•   2.2 原生质体制备
•   2.3 编辑效率结果分析
•     2.3.1 海岛棉基因组编辑检测分析
•     2.3.2 Cas9及其相关sgRNA表达量检测
•   2.4 脱靶效应检测结果
• 3 讨论
•   3.1 靶序列类型对编辑效率影响
•   3.2 靶序列类型对脱靶效率影响
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李继洋,胡燕,姚瑞,代培红,刘晓东

关键词: 棉花,编辑效率,脱靶效率,类型

来源: 作物学报 2019年10期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,农作物

单位: 新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术重点实验室,石河子大学生命科学院

分类号: S562;Q943.2

页码: 1522-1534

总页数: 13

文件大小: 8206K

下载量: 305