基于寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶活性的抗病毒抑制剂筛选

论文摘要

寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）为单股正链RNA病毒,主要通过蚊虫媒介传播。该病毒可以穿过血脑屏障,进而引发一些神经并发症和先天性寨卡病毒综合症,并造成不可逆的神经损害。随着该病毒在全球范围内迅速蔓延,已引起国际卫生组织的高度重视,然目前市场上却没有针对寨卡病毒的特异性药物,因此寻求抗寨卡病毒药物迫在眉睫。ZIKV NS3蛋白酶主要功能是将病毒形成的多聚蛋白切割为独立的功能蛋白,是病毒复制所必需的,因此是一种潜在的抗病毒药物靶标。本研究开展了基于ZIKV NS2B-NS3蛋白酶活性的抗病毒抑制剂筛选。通过荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）方法在体外检测了该蛋白酶的活性,并由此建立了高通量筛选的方法。对本实验室保存的化合物进行筛选,在复筛中获得一些对该蛋白酶具有较好抑制作用的化合物,挑选出一种具有相对较好抑制作用的化合物在细胞水平和动物活体水平上进行了抗病毒作用的研究。具体实验结果如下:1.ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的可溶性表达及化合物库的高通量筛选本研究对表达载体、感受态菌株和诱导温度、时间进行了摸索,最终得到最优的可溶性表达条件,并通过镍柱亲和层析方法纯化得到了大量可溶性的ZIKVNS2B-NS3蛋白酶。然后运用FRET方法检测了ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的活性,并计算求得S/B=13.60和Z′=0.51,该值均符合高通量筛选要求,就对实验室保存的四千多种小分子化合物库进行了筛选。通过初筛和复筛,剔除本身带荧光的假阳性化合物和加样误差造成的假阳性化合物,最终得到抑制率大于80%的十种小分子抑制剂。并将以上十种化合物在DENV、JEV和WNV NS3蛋白酶上进行体外酶活抑制试验,由试验可知,其中对DENV和JEV蛋白酶均有较好抑制作用的有八种化合物,而对WNV蛋白酶较好抑制作用的仅有三种。在此试验基础上我们挑选一种化合物CS-004/04003052进行更深一步的研究。得到以下结果:2.化合物CS-004/04003052的酶动力学研究及其对ZIKV蛋白酶抑制作用的特异性将化合物进行不同浓度的稀释并在不同底物浓度下测蛋白酶的反应速率,作反应速率-底物浓度双倒数曲线,根据米氏方程可知该化合物的抑制常数Ki值为0.1346±0.0243μM/L,且依据各直线相较于X轴,表明该化合物与底物之间是竞争性抑制作用。通过Microscale thermophoresis Test（MST）试验分析数据测定了化合物的酶结合常数Kd值为12.262±5.549μM。其次我们将化合物CS-004/04003052分别在ZIKV、DENV、JEV NS3蛋白酶和PEDV NSP5蛋白酶上进行体外酶活性抑制实验,结果发现该化合物CS-004/04003052只对ZIKV NS3蛋白酶表现出高度特异性抑制作用。3.细胞水平抗病毒作用检测将化合物CS-004/04003052倍比稀释成200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.59μM八个浓度分别加入Vero、BHK-21、Hela细胞,待48h后,加入Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂,然后加入等体积的检测试剂,读取并保存数据、分析数据,并计算CC50,结合测得的IC50可知,该化合物在较高浓度下仍对三种细胞的毒性甚小。通过分析空斑试验结果表明该化合物可抑制寨卡病毒的滴度;间接免疫荧光试验和Western blot试验结果均表明该化合物能抑制寨卡病毒的蛋白表达。同时我们也在细胞水平上探究了该化合物对乙脑病毒的复制是否存在抑制作用,结合空斑试验和Western blot试验结果均表明在细胞水平上该化合物对乙脑病毒的复制无抑制作用。4.动物水平抗病毒作用将化合物CS-004/04003052通过尾静脉注射AG129小鼠,进行抗寨卡病毒体内作用研究。试验结果表明,病毒组该化合物能延缓感小鼠染寨卡病毒的死亡时间。且通过HE切片染色结果分析可知在脑、睾丸、卵巢和脾组织内,给药组内的病理症状与病毒组相比明显得以改善;同时根据荧光定量PCR和空斑试验结果均表明在以上组织内药物组体内病毒的含量显著低于对照组。综合分析可知化合物CS-004/04003052在动物活体水平上对寨卡病毒具有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 1.文献综述
•   1.1 寨卡病毒的起源与爆发
•   1.2 寨卡病毒的分布与传播
•     1.2.1 ZIKV分布状况
•     1.2.2 ZIKV传播媒介与方式
•   1.3 寨卡病毒的病原学特征
•     1.3.1 寨卡病毒的基因组结构
•     1.3.2 寨卡病毒的蛋白及其功能
•     1.3.3 寨卡病毒的入侵和复制
•   1.4 寨卡病毒的临床症状和病理变化
•     1.4.1 临床症状
•     1.4.2 病理变化-神经并发症
•     1.4.3 病理变化-先天性寨卡病毒综合症
•   1.5 寨卡病毒的检测与防治
•     1.5.1 检测
•     1.5.2 防治
•   1.6 寨卡病毒NS3 蛋白酶的结构特点
•   1.7 NS3 蛋白酶作为潜在的抗病毒药物靶标
•   1.8 药物高通量筛选的研究和小分子药物的设计
•     1.8.1 基于高通量筛选药物的研究
•     1.8.2 小分子药物设计
• 2.研究目的和意义
• 3.实验材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 毒株、细胞与菌种
•     3.1.2 质粒与载体
•     3.1.3 荧光底物的设计
•     3.1.4 主要药品及试剂
•     3.1.5 主要培养基及相关溶液
•     3.1.6 主要缓冲液
•       3.1.6.1 50 ×TAE缓冲液
•       3.1.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液
•       3.1.6.3 Western blot缓冲液的配制
•       3.1.6.4 蛋白纯化缓冲液
•       3.1.6.5 其他相关缓冲液及抗生素
•       3.1.6.6 蛋白酶活性测定相关溶液的配制
•     3.1.7 引物设计
•       3.1.7.1 PCR引物序列
•     3.1.8 化合物库
•     3.1.9 实验动物
•     3.1.10 实验所用手术器械
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 ZIKVNS2B-NS3 蛋白酶的表达
•       3.2.1.1 ZIKV NS2B和 NS3 蛋白酶目的基因的扩增
•       3.2.1.2 ZIKV NS2B和 NS3 蛋白酶目的片段的回收
•       3.2.1.3 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶目的基因的扩增
•       3.2.1.4 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶目的片段的回收
•       3.2.1.5 限制性内切酶反应
•       3.2.1.6 目的片段与表达载体的连接
•       3.2.1.7 连接产物的转化
•       3.2.1.8 重组质粒的提取及鉴定
•       3.2.1.9 pET-30a/28a-ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶的小量诱导表达
•       3.2.1.10 BCA法测定蛋白浓度
•     3.2.2 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶的活性检测及高通量筛选体系的确定
•     3.2.3 基于ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶活性的小分子抑制剂筛选
•       3.2.3.1 化合物碎片库的初筛
•       3.2.3.2 化合物碎片库的复筛
•       3.2.3.3 阳性抑制剂对JEV、WNV和 DENV NS2B-NS3 蛋白酶的抑制效果
•     3.2.4 化合物CS-004/04003052对ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶的抑制特异性
•     3.2.5 化合物CS-004/04003052 对蛋白酶的动力学研究
•     3.2.6 化合物CS-004/04003052 细胞毒性的测定
•     3.2.7 病毒增殖的空斑减少试验
•     3.2.8 Western blot检测化合物的抗病毒活性
•     3.2.9 间接免疫荧光试验检测化合物的抗病毒活性试验
•     3.2.10 化合物CS-004/04003052 在不同阶段抑制寨卡病毒的研究
•     3.2.11 荧光定量PCR检测病毒基因mRNA水平
•       3.2.11.1 细胞总RNA的提取
•       3.2.11.2 细胞mRNA水平的检测
•     3.2.12 化合物CS-004/04003052对乙脑病毒增殖的空斑减少效应
•     3.2.13 化合物CS-004/04003052 对乙脑病毒在细胞中蛋白表达的抑制作用
•     3.2.14 化合物CS-004/04003052 在动物体内抗病毒活性的研究
•     3.2.15 统计学分析
• 4.结果与分析
•   4.1 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶的原核表达及纯化
•     4.1.1 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶原核表达质粒的构建
•       4.1.1.1 ZIKV NS2B和 NS3 蛋白酶基因的扩增
•       4.1.1.2 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶基因的扩增
•     4.1.2 重组原核表达质粒pET-30a/28a-NS2B-NS3 的酶切鉴定
•     4.1.3 NS2B-NS3 蛋白酶的表达与大量纯化
•       4.1.3.1 小量表达条件的摸索
•       4.1.3.2 大量纯化
•   4.2 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶的酶切活性检测
•   4.3 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶抑制剂高通量筛选
•     4.3.1 高通量筛选相关系数要求
•     4.3.2 化合物分子库的初筛
•   4.4 十种阳性化合物的基础研究
•     4.4.1 阳性化合物在ZIKV、DENV、JEV和 WNV NS3 蛋白酶上的验证
•     4.4.2 化合物IC50和CC50的测定
•   4.5 化合物CS-004/04003052对ZIKV NS3 蛋白酶的特异性抑制
•   4.6 化合物CS-004/04003052 对蛋白酶的动力学研究
•     4.6.1 酶抑制常数测定
•     4.6.2 化合物与蛋白酶结合常数测定
•   4.7 化合物CS-004/04003052 对细胞的毒性测定
•   4.8 化合物CS-004/04003052 对寨卡病毒复制的影响
•   4.9 化合物CS-004/04003052 在病毒增殖不同阶段抑制效果的研究
•   4.10 化合物CS-004/04003052 对乙脑病毒复制的影响
•   4.11 化合物CS-004/04003052在AG129 小鼠体内抗病毒效果研究
•     4.11.1 小鼠感染ZIKV后其存活率及体重变化
•     4.11.2 小鼠感染ZIKV后各组织的病理变化
•       4.11.2.1 小鼠感染ZIKV后脑组织的病理变化
•       4.11.2.2 小鼠感染ZIKV后睾丸组织的病理变化
•       4.11.2.3 小鼠感染ZIKV后卵巢组织的病理变化
•       4.11.2.4 小鼠感染ZIKV后脾脏组织的病理变化
•     4.11.3 小鼠感染ZIKV后各个组织脏器内病毒的分布
•       4.11.3.1 小鼠感染ZIKV后脑组织内病毒的检测
•       4.11.3.2 小鼠感染ZIKV后睾丸组织内病毒的检测
•       4.11.3.3 小鼠感染ZIKV后卵巢组织内病毒的检测
•       4.11.3.4 小鼠感染ZIKV后脾脏组织内病毒的检测
• 5.讨论与结论
•   5.1 讨论
•     5.1.1 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶的可溶性表达
•     5.1.2 小分子化合物库的高通量筛选
•     5.1.3 阳性化合物在DENV、JEV和 WNV NS3 蛋白酶的抑制
•     5.1.4 化合物CS-004/04003052对ZIKV NS3 蛋白酶的特异性抑制
•     5.1.5 化合物CS-004/04003052 对蛋白酶的动力学研究
•     5.1.6 化合物CS-004/04003052 在细胞水平上抗ZIKV作用的研究
•     5.1.7 化合物CS-004/04003052在AG129 小鼠体内抗病毒效果研究
•   5.2 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苗娟

导师: 宋云峰

关键词: 寨卡病毒,蛋白酶,高通量筛选,抗病毒药物,小鼠

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 华中农业大学

分类号: R373

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000773

总页数: 91

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