冠突曲霉钙信号调控基因Fig的功能研究

论文摘要

冠突曲霉(Aspergillus cristatus)是茯砖茶品质的标志性真菌,在人工培养基上,通过控制渗透压高低即NaCl的浓度,可获得纯子囊孢子或分生孢子,一般真菌是通过高渗透压甘油途径(HOG)作出对渗透压环境反应,本实验室对冠突曲霉(A.cristatus)低渗和高渗条件下的转录组测序数据分析发现:在高渗透压培养条件下HOG途径没有被激活,说明该真菌不是通过该途径调节产孢。有研究报道钙信号途径参与渗透压的响应,我们推测钙信号途径参与该菌对渗透压的响应,其中质膜上的钙离子转运蛋白的基因Fig,能够转运钙离子,可能与有性发育、无性产孢及菌丝生长有密切关系,因此,本研究选择冠突曲霉Fig基因作为研究对象,开展了敲除载体的构建,根癌农杆菌介导转化,胞外钙和钙螯合剂对突变菌株影响等研究,获得以下结果:(1)Fig基因全长994 bp,有3个内含子,预测编码271个氨基酸,含有四个跨膜区,属于疏水蛋白,在第一和第二个跨膜区之间有保守基序GΦΦGxC(n)C,与其他曲霉Fig基因的进行同源对比发现,Fig基因结构保守,保守结构域及跨膜结构基本相似;(2)通过同源重组的方法构建基因敲除载体,利用根癌农杆菌介导转化法获得Fig基因敲除菌株,敲除菌株显微结构观察发现,其子囊孢子及分生孢子形态特征与野生型差别不大,但孢子数量差异显著,与野生型相比,子囊孢子产量下调5倍,分生孢子产量下调4倍。敲除菌株对渗透压和氧化压力的影响,与野生型比较,没有明显的变化;(3)在添加不同浓度的胞外钙离子时发现:在低渗条件下,Fig基因敲除菌株菌丝生长速率低于野生型,子囊孢子产生量下降,添加钙离子螯合剂并不能恢复有性产孢,但生长速率与野生型一致,暗示Fig基因可以通过控制钙离子的进入影响菌丝的生长,可能通过影响其他途径来参与有性产孢的调控;在高渗条件下,敲除菌株较野生型更易向有性发育方向发展,且随着钙离子浓度的增加,敲除菌株分生孢子产生量进一步下降,钙离子螯合剂可以恢复敲除菌株的分生孢子的产量,说明在高渗条件下Fig基因对钙离子的吸收有一定的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
•   1.1 冠突曲霉的分离、纯化及鉴定
•   1.2 冠突曲霉与茯砖茶品质
•   1.3 冠突曲霉的保健功效
•   1.4 丝状真菌产孢机制的研究
•     1.4.1 丝状真菌无性产孢机制的研究
•     1.4.2 丝状真菌有性产孢机制的研究
•     1.4.3 冠突曲霉产孢相关基因的研究
•   1.5 钙信号系统主要组分及功能
•     1.5.1 钙信号
•     1.5.2 四种钙离子通道蛋白
•       1.5.2.1 存在于细胞质中的钙通道蛋白
•       1.5.2.2 存在于细胞膜中的钙信号蛋白
•       1.5.2.3 存在于内质网及高尔基体膜上的钙通道蛋白
•       1.5.2.4 液泡上存在的钙信号调控蛋白
•     1.5.3 真菌钙信号途径对压力应答的响应
• 2 本研究的目的和意义
• 3 技术路线
• 4 关键技术
• 材料与方法
•   1 实验材料
•     1.1 菌种及载体
•     1.2 培养基
•     1.3 主要试剂
•     1.4 主要仪器
•   2.实验方法
•     2.1 冠突曲霉Fig基因序列分析
•     2.2 冠突曲霉Fig基因敲除株载体的构建
•       2.2.1 上下游同源臂的扩增
•       2.2.2 上游同源臂与载体pDHt/sk-hyg的连接
•     2.2.2.1 载体p DHt/sk-hyg的获得
•     2.2.2.2 上游同源臂的获得
•     2.2.2.3 上游同源臂与载体p DHt/sk-hyg的酶切
•     2.2.2.4 上游同源臂与载体p DHt/sk-hyg的连接
•     2.2.2.5 上游同源臂转化到载体p DHt/sk-hyg上
•     2.2.2.6 重组质粒Fig L-PDHt/sk-hyg的验证
•       2.2.3 下游同源臂与重组质粒Fig L-PDHt/sk-hyg的连接
•     2.2.3.1 下游同源臂的获得
•     2.2.3.2 下游同源臂与重组质粒Fig L-PDHt/sk-hyg的酶切
•     2.2.3.3 下游同源臂与重组质粒Fig L-PDHt/sk-hyg的连接
•     2.2.3.4 下游同源臂转化到重组质粒Fig L-pDHt/sk-hyg上
•     2.2.3.5 重组质粒Fig L-PDHt/sk-hyg-FigR的验证
•     2.3 重组质粒Fig L-PDHt/sk-hyg-FigR导入根癌农杆菌
•       2.3.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
•       2.3.2 重组质粒Fig L-PDHt/sk-hyg-FigR导入根癌农杆菌中
•       2.3.3 重组质粒转入根癌农杆菌的验证
•     2.4 敲除突变株的获得
•       2.4.1 冠突曲霉野生型与根癌农杆菌共培养
•       2.4.2 冠突曲霉Fig基因敲除突变株的筛选
•     2.5 敲除突变体?Fig的拷贝数检测
•     2.6 敲除突变株?Fig的形态观察
•       2.6.1 敲除突变株?Fig产孢形态结构的观察
•       2.6.2 敲除突变株?Fig有性自交的观察
•       2.6.3 渗透压对敲除突变株?Fig的影响
•       2.6.4 氧化压力对敲除株突变株?Fig的影响
•       2.6.5 胞外钙离子对敲除株突变株?Fig的影响
•       2.6.6 钙离子螯合剂EDTANa2 对敲除株突变株?Fig的影响
• 结果与分析
•   3.1 冠突曲霉Fig基因序列分析
•   3.2 上下游同源臂的扩增
•   3.3 上游同源臂与载体pDHt/sk-hyg的连接及验证
•   3.4 下游同源臂与重组质粒Fig L-pDHt/sk-hyg的连接及验证
•   3.5 敲除载体FigL-pDHt/sk-hyg-FigR导入根癌农杆菌
•   3.6 冠突曲霉Fig基因敲除株的验证
•   3.7 敲除突变株?Fig的拷贝数检测
•   3.8 敲除突变株?Fig产孢形态结构观察
•   3.9 敲除突变株?Fig有性自交的观察
•   3.10 渗透压对敲除突变株?Fig的影响
•   3.11 氧化压力对敲除株突变株?Fig的影响
•   3.12 胞外钙离子对敲除突变株?Fig的影响
•   3.13 钙离子螯合剂EDTANa2 对敲除株突变株?Fig的影响
• 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘逸梅

导师: 刘作易

关键词: 冠突曲霉,基因敲除,荧光定量,钙调控

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 贵州大学

分类号: Q933

总页数: 75

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