红平红球菌rpf基因突变、生物活性及应用研究

论文摘要

自然环境拥有丰富的微生物资源,目前实验室条件下能够培养的微生物只占总量的0.01%-1%。复苏促进因子Rpf（Resuscitation promoting factor,Rpf）是首次被发现能够促使休眠细菌复苏和生长的细胞因子。石油污染长期危害自然环境和人类健康,微生物修复已成为石油污染土壤修复的主要技术之一,然而自然环境中许多有石油降解活性的微生物处于难培养状态。本文通过突变技术研究红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）复苏促进因子Rpf的生物学性质及对休眠细胞的复苏促进作用,探究Rpf作用机理,并将纯化的重组Rpf蛋白用于自然环境中高效石油污染降解菌的分离筛选。将红平红球菌KB1的rpf基因重组质粒BL21-pET-32a-rpf在大肠杆菌中高效表达,利用Ni琼脂糖亲和层析纯化重组Rpf蛋白,SDS-PAGE电泳分析其表达蛋白的分子量为37 kDa,重组Rpf蛋白的溶菌酶活力为1760 U/mg,蛋白酶活力为1634 U/mg。0.1 mM的Zn2+能增加溶菌酶活性,Ca2+、Mg2+、Co2+、DTT、EDTA、PMSF等对其溶菌酶活性影响不明显。纯化的重组Rpf蛋白对红平红球菌KB1的生长有明显促进作用,且能促进VBNC状态KB1细胞的复苏,复苏效果随重组Rpf蛋白浓度的增加而更加显著。利用定点突变技术对rpf基因序列溶菌酶活性相关部分氨基酸Asp45,Cys50,Glu51,Thr60,Gln69,Thr74,Trp75和Cys114进行了定点突变,构建了几种不同Rpf氨基酸突变体质粒,在大肠杆菌中诱导表达及Ni琼脂糖亲和层析纯化,发现突变后的Rpf溶菌酶活性发生了不同程度改变,其中C50G+C114T突变体溶菌酶活性丧失了86.68%,D45A+E51K突变体溶菌酶活性丧失了84.43%,Q69K突变体溶菌酶活性丧失86.11%,E51A突变体活性丧失11.14%,而W75V突变体的溶菌酶活性增加了94.45%。Rpf促生长和复苏作用与溶菌酶活性密切相关,C50G+C114T突变体的促生长作用和复苏作用消失,W75V突变体能显著增加红平红球菌细胞生长及非可培养细胞的复苏。将红平红球菌重组Rpf蛋白添加到石油污染土壤样品中,研究了其对土壤中石油降解菌的分离效果,发现添加Rpf能促进土壤中石油降解微生物的分离效果。从添加Rpf的土壤样品新分离出9株石油降解细菌,通过16S rDNA序列分析确定其分别属于芽孢杆菌属（Bacillus）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、赖氏菌属（Leifsonia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）。用红外测油仪测定所分离菌株对石油的降解作用,发现芽孢杆菌（Bacillus sp.）JC1、（Bacillus sp.）JD5、（Bacillus sp.）FD1、（Bacillus sp.）JP3和（Bacillus sp.）FP3的降解率为43.94%、41.58%、28.96%、44.38%和29.87%,苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）JP1和（Ochrobactrum sp.）FP1的降解率分别为36.12%和34.27%,微杆菌（Microbacterium sp.）JD2和（Microbacterium sp.）FD2的降解率为26.01%和20.46%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 细菌活的非可培养（VBNC）状态研究状况
•     1.1.1 VBNC状态细菌及其形成
•     1.1.2 VBNC状态细菌的生物学特性
•     1.1.3 VBNC状态细菌的检测和复苏
•   1.2 复苏促进因子（Rpf）的研究进展
•     1.2.1 Rpf的发现
•     1.2.2 Rpf家族基因特性
•     1.2.3 Rpf的广泛应用
•   1.3 石油污染土壤修复研究
•     1.3.1 石油污染土壤治理办法
•     1.3.2 石油降解微生物
•   1.4 本课题的研究目的意义
• 第2章 红平红球菌Rpf原核表达及性质研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 培养基、试剂及仪器
•     2.1.3 红平红球菌rpf基因在大肠杆菌中表达及纯化
•     2.1.4 重组Rpf蛋白的SDS-PAGE分析
•     2.1.5 Western-Blotting检验重组Rpf蛋白
•     2.1.6 蛋白质浓度测定
•     2.1.7 重组Rpf蛋白溶菌酶活性测定
•     2.1.8 金属离子和蛋白酶抑制剂对Rpf溶菌酶活性影响
•     2.1.9 重组Rpf的蛋白酶活性测定
•     2.1.10 重组Rpf对牛血清白蛋白水解活性
•     2.1.11 Rpf蛋白对正常培养的红平红球菌的促生长作用
•     2.1.12 Rpf蛋白对VBNC状态的红平红球菌的复苏作用
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 红平红球菌KB1 重组Rpf蛋白的纯化及SDS-PAGE鉴定
•     2.2.2 重组Rpf蛋白的Western-Blotting鉴定
•     2.2.3 重组Rpf蛋白的酶活性
•     2.2.4 不同金属离子和抑制剂对Rpf酶活性的影响
•     2.2.5 重组Rpf蛋白对牛血清白蛋白水解作用
•     2.2.6 重组Rpf蛋白对红平红球菌KB1 的促生长作用
•     2.2.7 重组Rpf蛋白对VBNC状态的红平红球菌KB1 的复苏作用
•   2.3 讨论与结果
• 第3章 Rpf基因定点突变体构建、表达及性质研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 菌株及质粒
•     3.1.2 主要试剂与仪器
•     3.1.3 Rpf基因突变位点的选择及突变点序列
•     3.1.4 突变体表达质粒的酶切与序列鉴定
•     3.1.5 感受态细胞的制备
•     3.1.6 重组质粒的转化与抽提
•     3.1.7 Rpf突变蛋白表达与纯化
•     3.1.8 纯化的Rpf突变蛋白浓度测定
•     3.1.9 纯化的Rpf突变蛋白溶菌酶活性测定
•     3.1.10 纯化的Rpf突变蛋白溶蛋白酶活性测定
•     3.1.11 Rpf突变体蛋白对正常状态红平红球菌生长促进作用
•     3.1.12 Rpf突变体蛋白对VBNC状态的红平红球菌的复苏作用
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 Rpf突变蛋白表达及纯化
•     3.2.2 纯化的Rpf突变体蛋白的浓度
•     3.2.3 纯化的Rpf突变体蛋白溶菌酶、蛋白酶活性
•     3.2.4 Rpf突变体蛋白酰胺酶、酯酶活性
•     3.2.5 Rpf突变蛋白对红平红球菌KB1 的促生长作用
•     3.2.6 Rpf突变蛋白对VBNC状态的红平红球菌KB1 的复苏
•   3.3 讨论与结果
• 第4章 Rpf促进高效石油降解菌的分离及生长
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 菌株与培养基
•     4.1.2 主要试剂及仪器
•     4.1.3 添加Rpf对石油污染土壤微生物分离效果
•     4.1.4 石油降解效果测定
•     4.1.5 石油降解菌16S rDNA分析
•     4.1.6 重组Rpf蛋白对高效石油降解菌的促生长作用
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 重组Rpf蛋白对石油污染土壤可培养细菌数量的影响
•     4.2.2 分离石油降解菌鉴定与分析
•     4.2.3 降解菌石油降解率测定
•     4.2.4 重组Rpf蛋白对高效石油降解菌的促生长作用
•   4.3 讨论与结果
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 罗旦

导师: 陈吉祥,谢刚

关键词: 红平红球菌,非可培养状态,复苏促进因子,溶菌酶,石油降解菌

来源: 兰州理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 兰州理工大学

分类号: X172;X53

总页数: 65

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