平邑甜茶肌醇加氧酶基因的表达及功能研究

论文摘要

土壤盐渍化是目前制约农林业生产的全球性问题,干旱、盐碱等非生物逆境会对植物的生长代谢造成影响。经过长期进化,植物可以通过各种渗透调节、抗氧化调节等机制来抵御这些非生物胁迫。研究发现,肌醇（myo-inositol,MI）在植物抗逆过程中发挥着重要作用,在肌醇代谢过程中,肌醇-1-磷酸合酶（Myo-inositol-1-phosphate synthase,MIPS）是肌醇合成过程的限速酶,而肌醇加氧酶（Myo-inositol oxygenase,MIOX）则在催化肌醇分解的过程中起到了关键酶的作用。目前,关于肌醇代谢关键酶的研究大多是以拟南芥等草本植物为研究对象进行研究的,但是关于木本植物肌醇代谢关键酶基因的研究报道还比较少。挖掘苹果砧木平邑甜茶MIOX基因并进行功能研究,不但具有重要的理论意义,而且具有广泛的应用价值,可以为植物抗逆转基因研究提供潜在的有效候选基因。本研究从平邑甜茶中克隆到一个MIOX基因,命名为MhMIOX1,并对其编码的氨基酸序列进行了比对,对其表达模式及其功能等进行了分析。主要研究工作与结果如下:1、从平邑甜茶中分离得到一个编码MIOX的基因序列,命名为MhMIOX1。MhMIOX1编码333个氨基酸,平邑甜茶MIOX基因编码的氨基酸序列与其他物种的MIOX基因编码的氨基酸序列同源性和木本植物中的桃最高,相似度达90%以上。2、我们对平邑甜茶组培苗分别用NaCl、PEG、ABA处理,利用RT-PCR技术分析MhMIOX1基因对这三种非生物逆境胁迫的响应,结果显示,3种胁迫处理均会引起MhMIOX1的表达上调,由此可以推测,MhMIOX1基因可能在植物对抗非生物胁迫响应中发挥重要作用。3、为了验证MhMIOX1基因在参与盐胁迫响应中的作用,我们首先利用草本模式植物拟南芥对其进行功能分析。结果显示,过量表达的MhMIOX1基因能够提高草本植物拟南芥在盐胁迫处理下的萌发率、根长及长势。进一步将MhMIOX1基因转化木本模式植物山新杨,在盐胁迫处理下,转MhMIOX1基因拟南芥和山新杨的长势均明显优于野生型。以上结果表明,MhMIOX1基因过表达一定程度上可以提高植物对盐胁迫的耐受性。4、为了更好地说明MhMIOX1基因的功能,我们利用遗传转化获得的转MhMIOX1基因山新杨,在不同浓度的盐胁迫下进行处理,结果显示,转MhMIOX1基因山新杨的长势均明显优于野生型,说明转MhMIOX1基因山新杨比野生型山新杨有更好的耐盐性。我们进一步研究了MhMIOX1基因过表达对转基因山新杨活性氧的积累量及抗氧化酶活性的影响。结果表明,野生型和转MhMIOX1基因山新杨在不同浓度盐胁迫下H2O2和MDA的积累量均随盐浓度的升高而升高,但在相同NaCl水平下,转MhMIOX1基因山新杨H2O2和MDA的积累量均显著低于野生型,而过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶的活性都明显高于野生型山新杨。由此说明过表达的MhMIOX1基因能够通过某种机制来增强抗氧化酶的活性,降低活性氧的含量,减轻活性氧对细胞膜的伤害,从而提高了植物的抗逆性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 植物与逆境胁迫
•     1.1.1 高盐对植物生长发育的影响及其响应机制
•     1.1.2 干旱胁迫对植物生长发育的影响及其影响机制
•     1.1.3 高温胁迫对植物生长发育的影响及其影响机制
•     1.1.4 活性氧的产生和清除
•   1.2 肌醇及植物逆境调节
•     1.2.1 肌醇的发现
•     1.2.2 肌醇的代谢途径
•     1.2.3 肌醇衍生物及其作用
•       1.2.3.1 磷脂酰肌醇衍生物
•       1.2.3.2 多磷酸肌醇及其激酶
•     1.2.4 肌醇加氧酶基因
•     1.2.5 肌醇加氧酶基因在植物抗逆中的作用
•   1.3 本研究的意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 实验材料、菌株及载体
•     2.1.2 抗生素、生长激素及培养基的配制
•     2.1.3
•       2.1.3.1 拟南芥筛选培养基
•       2.1.3.2 杨树培养基
•     2.1.4 酶、试剂盒、生化试剂及仪器设备
•     2.1.5 PCR引物
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 植物总RNA的提取
•     2.2.2 反转录cDNA
•     2.2.3 MhMIOX1基因的扩增
•       2.2.3.1 PCR扩增
•       2.2.3.2 MhMIOX1基因PCR扩增产物的回收
•     2.2.4 MhMIOX1序列的分析
•     2.2.5 MhMIOX1基因表达的模式
•       2.2.5.1 平邑甜茶苗胁迫处理
•       2.2.5.2 RNA提取
•       2.2.5.3 实时荧光定量PCR分析
•     2.2.5.3.1 反转录cDNA
•     2.2.5.3.2 实时定量PCR
•     2.2.6 MhMIOX1表达载体的构建
•       2.2.6.1 目的基因的扩增
•       2.2.6.2 目的片段收取
•       2.2.6.4 连接载体
•       2.2.6.5 大肠杆菌转化
•       2.2.6.6 菌落PCR扩增
•       2.2.6.7 提质粒、酶切鉴定
•       2.2.6.8 农杆菌转化
•       2.2.6.9 菌落PCR鉴定
•     2.2.7 转基因拟南芥的基因功能鉴定
•       2.2.7.1 农杆菌介导的拟南芥转化—花序侵染法
•       2.2.7.2 转基因拟南芥的鉴定
•       2.2.7.3 转基因拟南芥植株RT-PCR表达水平鉴定
•       2.2.7.4 转基因拟南芥相关指标测定
•     2.2.8 杨树转基因
•       2.2.8.1 农杆菌介导的杨树转化—叶盘法
•       2.2.8.2 转基因杨树苗RT-PCR表达水平鉴定
•       2.2.8.3 转基因杨树盐胁迫处理
•       2.2.8.4 转基因杨树胁迫生理指标测定
•     2.2.8.4.1 丙二醛含量测定
•     2.2.8.4.2 过氧化氢含量测定
•     2.2.8.4.3 过氧化物酶（POD）活性的测定
•     2.2.8.4.4 过氧化氢酶（CAT）活性的检测
•     2.2.8.4.5 抗坏血酸过氧化物酶（APX）含量测定
•     2.2.8.4.6 抗坏血酸（Vc）含量测定
•     2.2.8.4.7 可溶性蛋白含量的测定
• 第3章 实验结果与分析
•   3.1 MhMIOX1基因分子克隆结果
•     3.1.1 目的基因扩增电泳结果
•     3.1.2 MhMIOX1进化树分析
•   3.2 MdMIOX1基因表达模式分析
•   3.3 MhMIOX1基因过表达载体的构建
•   3.4 转MhMIOX1基因拟南芥的盐胁迫分析
•     3.4.1 转MhMIOX1基因拟南芥的获得
•     3.4.2 转MhMIOX1基因拟南芥的检测
•     3.4.3 转MhMIOX1基因拟南芥耐盐性分析
•   3.5 转MhMIOX1基因杨树盐胁迫分析
•     3.5.1 转MhMIOX1基因杨树苗的获得
•     3.5.2 转MhMIOX1基因杨树苗抗性植株检测及肌醇含量测定
•     3.5.3 盐胁迫下的生长变化
•     3.5.4 盐胁迫下生理指标的测定
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张静

导师: 王磊

关键词: 平邑甜茶,肌醇,肌醇加氧酶,胁迫,拟南芥,杨树

来源: 鲁东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农业基础科学,农艺学

单位: 鲁东大学

分类号: S156.4;Q943.2

总页数: 70

文件大小: 5109K

下载量: 40