一、二氟沙星人工抗原的合成与鉴定（论文文献综述）
杜加茹[1]（2020）在《氟罗沙星噬菌体抗体库的构建及鉴定》文中指出目的氟罗沙星（Fleroxacin,FLE）是在医学临床以及动物饲料添加剂中广泛应用的一种氟喹诺酮类抗菌药物,由于其广谱抗菌作用,在动物源性食品及药品中过度使用导致残留量过高,严重威胁人类的身体健康,进一步加强监测并提高其检测方法很有必要。本研究旨在构建天然鼠源噬菌体抗体库,从中筛选氟罗沙星单链抗体并进行表达与鉴定。基于基因工程方法制备的重组抗体作为第三代抗体,生产周期短且容易改造,为快速低成本制备目的抗体提供了新的方法。方法1.选用未经免疫的健康Balb/c小鼠,提取总细胞RNA,反转录为cDNA作为模板,经RT-PCR扩增出抗体的重链可变区与轻链可变区基因,经重叠延伸PCR用Linker（Gly4Ser）3连接,组装成为单链抗体基因,并引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。双酶切目的片段与噬菌粒pCANTAB5E并连接,电转化E.coli TG1,构建出初级噬菌体抗体库。2.合成氟罗沙星的人工抗原,以FLE-OVA为包被原对抗体库进行三轮富集筛选,随机选择10株单克隆进行phage-ELISA鉴定及基因测序。3.氟罗沙星单链抗体和pET-32a载体经BglⅡ和HindⅢ限制酶消化后,用T4连接酶将FLE-ScFv插入pET-32a载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株并在LB培养基中震荡培养至OD600达到0.7,加入1.0 mmol/L IPTG置于20℃摇床诱导表达10h。离心收集菌体用PBS重悬,超声破碎后收集上清与沉淀,磁珠纯化后SDS-PAGE与Western blot分析蛋白表达,ELISA鉴定效价与抑制。结果1.扩增出340bp的抗体重链可变区与320bp的抗体轻链可变区基因,拼接获得约750bp的单链抗体片段,成功构建库容量大小为2.1 ×1011的初级噬菌体抗体库。2.成功合成氟罗沙星的人工抗原,以FLE-OVA为包被原对抗体库进行三轮富集筛选结果表明:噬菌体回收率逐轮增高,抗体库得到了有效的富集。phage-ELISA结果表明:成功筛选得到能够与FLE-OVA特异性结合的氟罗沙星单链抗体。3.纯化后的FLE-ScFv的SDS-PAGE与Western blot结果表明:抗体在大肠杆菌中主要为包涵体表达,获得大小约47kD的目的条带。基因测序结果经Ediseq序列分析,与单链可变区抗体基因的结构与特征相符。间接竞争ELISA鉴定结果:标准曲线回归方程的线性相关系数≥0.99,IC50为42ng/ml,能够检测出国家规定的氟罗沙星残留标准低限值以下的食品药品残留。结论本研究成功构建天然噬菌体单链抗体库,筛选获得能够与氟罗沙星特异性结合的单链抗体,为抗体的快速制备与检测以及食品药品残留的分析提供了技术支持。
刘卫华[2]（2019）在《动物源食品中氟甲喹快速免疫检测技术的研究》文中提出氟甲喹（flumequine,FLU）是一种动物专用的喹诺酮类抗生素,用于预防和治疗畜禽及水产类动物的疾病。但是,滥用或者超标使用的情况时有发生,造成动物性食品中的氟甲喹残留问题,对人类的健康造成极大的危害。世界各国都规定了动物性食品中氟甲喹残留的最大限量,作为食品安全监管的标准和依据,而建立简单、快速、高通量的检测方法也很有必要。本研究采用活泼酯法合成氟甲喹完全抗原,通过免疫动物制备了多克隆抗体,建立了氟甲喹间接竞争酶联免疫分析方法（icELISA）;建立了氟甲喹固相膜免疫分析方法;制备了氟甲喹分子印迹膜,并将其作为人工抗体,建立了直接竞争仿生酶联免疫分析方法（BELISA）。建立的icELISA法和BELISA法适于大量样品的快速定量筛查,预处理简单,操作方便快速,检测限低;固相膜免疫分析方法适于快速定性筛查,准确可靠,简便易操作。氟甲喹完全抗原的合成及多克隆抗体的制备。采用活泼酯法将FLU半抗原与载体蛋白牛血清蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）偶联,制备出FLU-BSA（免疫原）和FLU-OVA（包被原）。通过紫外光谱扫描和SDS-PAGE凝胶电泳两种方法确定人工抗原成功地合成。用免疫原FLU-BSA免疫两只新西兰大耳白兔,获得抗血清（FLU-1和FLU-2）;采用间接竞争ELISA方法测定抗血清效价和亲和性,FLU-1与FLU-2效价相当（均为1:12800）,经纯化后,FLU-1抗体（IC50为0.06 ng/mL）亲和性明显高于FLU-2（IC50为0.21 ng/mL）,故选择FLU-1抗体进行后续免疫检测试验。氟甲喹残留的ELISA检测方法的建立。采用间接竞争ELISA法优化FLU的检测条件,最优条件为:包被量10 μg/mL,抗血清稀释度1:3200,封闭液为1%明胶,酶标二抗稀释度1:2500,pH值7.5,反应缓冲液是1×PBS,乙腈含量是0%～20%。在最优条件下建立间接竞争ELISA方法,该方法的IC50为2.03 ng/mL,最低检出限达1.21×10-4 ng/mL,具有比较高的准确性和灵敏度。将FLU与其结构类似物左氧氟沙星（LVX）、加替沙星（GAT）和氧氟沙星（OFX）进行交叉反应试验,交叉反应率都很低,抗体特异性好。选择牛肉、猪肉、虾肉、牛奶、熟猪肝和生猪肝作为试样,研究基质影响的消除方法。牛肉、猪肉和牛奶经过超声提取后以PBS稀释10倍,虾肉需稀释20倍,猪肝等内脏类需要稀释40倍,就可以有效地消除基质的影响。在加标回收试验中,在三个加标水平上的回收率在72.80%～97.30%之间。用HPLC法对建立的间接竞争ELISA法进行验证,其检测结果之间的拟合程度很高,相关系数R2均大于0.96,这可以说明所建立的ELISA方法准确、可靠、简便、快速,可用于动物性食品中氟甲喹残留的快速定量分析。氟甲喹残留的固相膜免疫检测方法的建立。采用柠檬酸三钠还原法制备出来胶体金,以胶体金标记FLU抗体制备出来免疫金。以硝酸纤维素（NC）膜作为固相载体,分别包被上FLU-OVA、酶标二抗作为T线、C线,对测定条件进行的优化结果是:封闭液为5%脱脂乳、酶标二抗最佳稀释倍数为40倍、包被量1.0 μg、免疫金稀释度为1:5（v/v）、金标抗体与待测溶液的混合比例为1:5（v/v）在最优条件下,制成FLU胶体金标记免疫层析固相膜,最低检出限为40 μg/L。对牛肉、猪肉、虾肉、牛奶、熟猪肝、生猪肝进行基质影响的消除试验,牛肉、猪肉、虾肉基质的提取液需用1×PBS缓冲液稀释20倍,牛奶、熟猪肝、生猪肝稀释40倍,可以消除基质的影响。加标回收试验的结果用肉眼观察即可看到有明显的梯度,说明方法有效。建立的胶体金标记固相膜免疫检测方法是一种定性检测方法,在实际的检测工作中无需仪器,目测结果即可,时间较短,适用于大批量样品的现场快速定性筛选。氟甲喹残留的BELISA检测方法的建立。通过分子动力学模拟,确定氟甲喹与甲基丙烯酸（MAA）结合的最佳摩尔比为1:2。以FLU为模板,以MAA作为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）作为交联剂,偶氮二异丁腈（AIBN）作为引发剂,以96孔酶标板作为固相载体,制备出了分子印迹膜（MIPs）。通过静态吸附试验和吸附动力学试验对其进行表征,结果表明分子印迹膜已经成功合成。采用活泼酯法制备酶标抗原,对BELISA反应体系的条件进行优化,确定的最优条件是:酶标抗原的稀释倍数为8000倍,pH为7.1,甲醇含量为5%的PBST缓冲液。在此条件下建立直接竞争BELISA法,该方法检测线性范围是1～100000 ng/mL,灵敏度IC50为140.62 ng/mL,检测限为1.09ng/mL。与结构类似物左氧氟沙星（LVX）、氧氟沙星（OFX）和依诺沙星（ENX）的交叉反应率分别为17.8%、17.5%和11.0%,表明该方法的特异性较高。采用直接稀释法进行基质消除,虾肉样品提取液经过20倍稀释、牛肉样品提取液经过40倍稀释后即可消除基质的干扰。三个加标水平下的回收率在80.7%～92.3%之间,这即可表明此样品前处理方法可行。通过HPLC法验证该方法的准确性,结果表明,HPLC与BELISA呈现良好的线性关系,相关系数R2在0.98以上,这说明建立的BELISA方法准确、可靠,可以用于动物性食品中氟甲喹残留的快速检测。
焦文阳[3]（2019）在《微囊藻毒素广谱性抗体晶体结构研究》文中认为微囊藻毒素（Microcystin,MCs）具有强烈的肝毒性,可以通过饮用水及在动植物中的积累接触人类,严重危害人类健康和生态安全。MCs家族庞大,仅目前报道出的结构类似物便有100多种,现有的免疫检测方法较难实现一次性检测出所有MCs残留,需要开发广谱性更佳的免疫检测方法。目前抗体与MCs的识别机制研究较少,尚难解答半抗原结构对抗体性能的影响及指导人工调控抗体广谱性能。实验室前期针对不同碳链长度的MCs共有结构半抗原（命名为LH和GAA）得到2株广谱性抗体。为了阐释抗体MCs广谱性识别机制,以期为抗体性能调控提供理论基础,本研究制备了高纯度的LH和GAA抗体Fab片段,并通过间接酶联免疫吸附法（icEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ic-ELISA）考察二者广谱特异性;运用蛋白质结晶方法,制备LH-Fab和GAA-Fab片段单体及其与代表性MCs复合物晶体,解析两株抗体与MCs的三维立体结构,并探讨影响MCs抗体广谱性的因素,取得如下主要结果:（1）建立了LH和GAA单克隆抗体酶解与纯化方法。采用木瓜蛋白酶对LH和GAA单克隆抗体进行酶解,在纯化酶解液的过程中,发现LH-Fab与凝胶过滤层析填料存在非特异性结合。利用此现象建立了LH-Fab利用凝胶过滤层析高效1步纯化方法。结合不同缓冲液p H与离子强度下LH-Fab在柱中的保留行为及其性质分析LHFab与凝胶过滤层析填料的结合机制,LH-Fab结合腔表面的强疏水性可能是引起二者结合的原因。此外建立了GAA-Fab利用Protein G和凝胶过滤层析2步纯化方法。获得的Fab片段纯度分别为94.5%,91%,回收率分别为51%,37%。（2）评价了LH和GAA抗体Fab片段的活性与广谱特异性。结果表明Fab片段相较于亲本单克隆抗体对MCs的灵敏度下降了约2-9倍,但二者均可以识别交叉反应率在36%以上的8种MCs及NOD-R,保持了较好的广谱特异性。LH-Fab对MCs灵敏度仍然高于GAA-Fab且对藻毒素保持了较一致的交叉反应率,故推测LH-Fab不识别MCs的取代位。GAA-Fab片段除MC-LW外对2号位为亮氨酸的MCs识别能力高于4号位为精氨酸的MCs,推测MCs 4位的空间位阻会使GAA-Fab的识别能力降低。（3）制备了LH-Fab单体及与MC-LR、NOD-R复合物和GAA-Fab单体及与MCLR/-LW、NOD-R复合物晶体并解析了分辨率在2.8?以下的LH-Fab-NOD-R、GAAFab、GAA-Fab-MC-LR/-NOD-R 4种晶体结构。晶体结构显示,LH-Fab和GAA-Fab结合腔深分别为12.2?、18.7?,口袋最窄处分别为7.2?、8.5?。2株抗体主要作用力是结合腔与MCs Adda片段间的疏水作用,是广谱性识别MCs的主要原因。此外LH-Fab中LCDR3-Trp97,HCDR1-Tyr32,HCDR2-Tyr49、HCDR2-Ser55,HCDR3-Ile98、HCDR3-Tyr100残基参与形成氢键和Pi-Pi堆积等相互作用,GAA-Fab中LCDR3-Lys91、LCDR3-Trp90,HCDR2-Trp47、HCDR2-Ser50、HCDR2-Tyr54、HCDR2-Tyr58,HCDR3-Arg104、HCDR3-Tyr106参与形成氢键、Pi-Pi堆积、静电作用等相互作用。GAA-Fab结合MCs时,LCDR3-Lys91、HCDR3-Arg104柔性摆动使结合腔口张开,是影响GAA-Fab结合MCs的关键氨基酸。（4）探讨了影响MCs抗体广谱性的主要因素。通过对抗体结构的分析和比较,发现LH-Fab抗体识别MCs的表位为共有基团Adda与Glu残基,不涉及取代位,因此LH-Fab对MCs和NOD-R的识别能力较一致。GAA-Fab抗体识别MCs的表位除Adda和Glu外还包括4位取代位,4位残基侧链空间位阻增大会阻碍Adda片段进入结合腔,导致结合活性降低,与配体4位残基有相互作用的HCDR2-Tyr54是影响GAA-Fab特异性的关键氨基酸。LH半抗原增加的双键结构使LH-Fab结合腔边缘疏水性大于GAA-Fab,导致LH-Fab与Adda双键的疏水结合增强,造成GAA-Fab广谱性与灵敏度低于LH-Fab。GAA-Fab复合物晶体中MC-LR和NOD-R的Adda肽键氧原子的空间取向不同,导致HCDR3-Arg104残基与NOD-R产生氢键作用结合活性增强,也是影响GAA-Fab广谱特异性的关键氨基酸。
徐田丽,苏国成,江晓颖,孙雪珂,江峰[4]（2017）在《抗诺氟沙星单克隆抗体的制备及其性质的研究》文中提出为了监测诺氟沙星抗生素的滥用,我们开发了一种基于单克隆抗体的酶联免疫方法。将小分子抗原诺氟沙星NOR通过碳二亚胺法与载体蛋白BSA、OVA进行偶联。得到完全抗原NOR-BSA和NOR-OVA。用NOR-BSA对3只雌性小鼠进行免疫后,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,用间接ELISA法和间接竞争ELISA法筛选阳性细胞进行克隆,得到3株稳定分泌抗体的单克隆细胞株,分别命名为7C4,8G3,11G7。检测细胞的上清液和纯化后的腹水效价,分别为1:512,1:1024,1:1024和1:128000,1:128000,1:128000。对三株细胞的亚型鉴定为IgG2b,IgG2b,IgG1。建立的标准竞争曲线计算得IC50值为31.225 ng,其检测线性范围为5.011-630.95 ng/mL,最低检出量为2.75 ng。亲和力常数Kaff为4.6×108。诺氟沙星单克隆抗体与环丙沙星（27.22%）、恩诺沙星（11.29%）、奥比沙星（11.03%）、氧氟沙星（9.73%）、达氟沙星（7.38%）、沙拉沙星（2.57%）、二氟沙星（0.61%）几种抗菌药有较低的交叉反应率。
陈佳虹[5]（2016）在《喹诺酮类药物广谱免疫分析研究》文中研究表明喹诺酮类药物是一类广谱抗菌的药物,广泛应用于动物疾病的预防和治疗,但其在动物源性食品中的残留严重危害消费者的健康。因此十分有必要加强对喹诺酮类的监测。目前针对喹诺酮类的监测方法主要是高效液相色谱法和毛细管电泳法等仪器方法。虽然灵敏度和准确性较高,但其用时长,成本高,前处理步骤繁琐,难以满足快速大批量的检测要求。而基于抗原-抗体反应的免疫分析方法具有操作简单,快速,灵敏和成本低等优点,适用于现场大批量的快速筛选,喹诺酮广谱免疫分析方法可同时检测两种及以上的药物,具有巨大的优势,在食品安全检测领域中的作用越来越重要,而实现广谱免疫分析关键在于获得广谱特异性抗体。本论文选取3种喹诺酮类药物为研究对象,结合结构特征进行广谱性半抗原/抗原的设计合成、多克隆抗体的制备及多种免疫分析方法研究,并探讨了喹诺酮类抗体的广谱识别机制。（1）吡哌酸为半抗原的广谱免疫分析研究吡哌酸具有喹诺酮母核结构特征,且在C-7位为广谱性药物特征结构-哌嗪环。因此选用吡哌酸为半抗原,制备吡哌酸抗体进行广谱性研究。基于异源策略建立吡哌酸免疫分析方法,半抑制浓度（IC50）为6.0 ng/mL,灵敏度明显增强。交叉反应结果显示,有18种喹诺酮类交叉反应率低于9.2%。表明吡哌酸抗体特异性较强。结合3D QSAR分析吡哌酸与广谱性药物诺氟沙星结构差异,不同于诺氟沙星C-7位哌嗪环平分于母环两侧,吡哌酸在C-7位的哌嗪环与母环在同一平面,呈“一”字型,形成抗体空腔较扁平,无法容纳导致较大的基团,是吡哌酸抗体广谱性能不佳的主要原因。此外,在N-1位带大基团或负电荷的原子影响抗体的结合亲和力。同时,应用所建立的方法研究鸡蛋中吡哌酸动态残留规律,结果显示吡哌酸在第5天达到峰值,第14天降低至100 ng/g以下。说明所建立的ELISA检测方法可用于食品中吡哌酸药物残留的检测和监控,并为吡哌酸在鸡蛋中的残留风险评估提供一定的科学依据。（2）克林沙星为半抗原的广谱免疫分析研究克林沙星与广谱性药物环丙沙星和恩诺沙星结构相似,仅在C-7位和C-8位上基团不同。与上一章吡哌酸相比,它在C-8位带有氯原子基团,可与N-1位基团相互作用形成类似环的结构。基于此,选用克林沙星为半抗原制备抗体进行广谱免疫分析研究。在同源模式下,从不同位点合成两种克林沙星示踪物。优化选择最优组合建立FPIA方法,IC50为25.6 ng/mL,灵敏度较高。特异性结果显示19种喹诺酮交叉反应率均低于5%,克林沙星抗体特异性较强。3D QSAR研究发现克林沙星在C-7位的五元环和氨基形成的空腔较小,且偏向一边,无法容纳像哌嗪环一样的大基团,是克林沙星抗体广谱性较差的主要原因。此外C-8位和N-1位非环状结构也导致克林沙星无法识别在此位点为环状结构的喹诺酮类药物。应用FPIA方法检测牛奶中克林沙星,添加回收率为97.9%112.7%,批内变异系数均低于7.1%,高效液相色谱法（HPLC）验证显示两者具有良好的一致性。说明本方法适用于牛奶样品中克林沙星的监测和分析。基于异源竞争模式建立羊奶中克林沙星FPIA方法。设计合成克林沙星同源示踪物和五种异源示踪物,比较并筛选出异源示踪物PAZ-FITC与克林沙星抗体组合最优,FPIA法结果显示IC50为29.3 ng/mL,灵敏度明显提高,为同源组合的6倍。在羊奶中平均添加回收率为96.6%,平均变异系数为5.3%,可满足快速检测的需求。说明基于异源策略的FPIA方法是一种快速、高通量的检测方法,可用于羊奶样品中克林沙星的监测和分析。此外,发现帕珠沙星作为异源示踪物可提高抗体亲和力和特异性,因此,在之后选用帕珠沙星作为半抗原进行抗体制备和性能研究。（3）帕珠沙星为半抗原的广谱免疫分析研究不同于大部分喹诺酮类药物带有哌嗪环,帕珠沙星在C-7位的基团为氨基环丙基,且在C-8位和N-1位为氧氮杂环,可能可提高广谱性。本研究选用帕珠沙星制备多克隆抗体。优化条件选择最优组合建立高灵敏的ELISA方法,结果显示所建立的ELISA方法IC50为10.3 ng/mL,灵敏度较高。特异性分析结果显示帕珠沙星抗体可识别24种喹诺酮类药物,具有广谱性。应用3D QSAR分析发现立体场对抗体识别起主要作用,在C-7位的氨基和环丙基形成的V形结构可形成较大空腔,是帕珠沙星抗体具有广谱识别性能的主要因素,在C-8位和N-1位为氧氮杂环,有利于识别在相同位置为环状或类似环状结构的喹诺酮类,在N-1位上带大基团不利于抗体的结合亲和力。综上所述,本研究选用吡哌酸、克林沙星和帕珠沙星3种喹诺酮药物为对象,偶联制备多克隆抗体进行广谱性免疫分析研究,应用3D QSAR分析发现立体场对抗体识别起主要作用,C-7位的基团对应抗体空腔的大小是影响抗体广谱识别性能的主要因素。在C-8位和N-1位的环状结构有利于提高抗体广谱性,在N-1位上带大基团不利于抗体的结合亲和力。
徐田丽[6]（2016）在《诺氟沙星单克隆抗体的制备和胶体金试纸条的研制》文中研究表明诺氟沙星（NOR）是喹诺酮类的一种,广泛的用于动物各种感染性疾病的治疗,然而NOR在禽畜产品的残留严重危害人们的健康。免疫学分析方法是基于抗原抗体的反应,具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,并且可快速的检测多种样品。因此,本实验将通过制备抗NOR单克隆抗体的免疫学分析方法,检测样品中的NOR的含量。将小分子抗原诺氟沙星NOR通过碳二亚胺法与载体蛋白BSA、OVA进行偶联。得到完全抗原NOR-BSA和NOR-OVA。用NOR-BSA对3只雌性小鼠进行免疫后,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,用间接ELISA法和间接竞争ELISA法筛选阳性细胞进行克隆,得到3株稳定分泌抗体的单克隆细胞株,分别命名为7C4,8G3,11G7。检测细胞的上清液和纯化后的腹水效价,分别为1:512,1:1024,1:1024和1:128000,1:128000,1:128000。对三株细胞的亚型鉴定为IgG2b,IgG2b,IgG1。建立的标准竞争曲线计算得IC50值为31.225 ng,其检测线性范围为5.011-630.95 ng/mL,最低检出量为2.75 ng。亲和力常数Kaff为4.6×108。诺氟沙星单克隆抗体与环丙沙星（27.22%）、恩诺沙星（11.29%）、奥比沙星（11.03%）、氧氟沙星（9.73%）、达氟沙星（7.38%）、沙拉沙星（2.57%）、二氟沙星（0.61%）几种抗菌药有较低的交叉反应率。将其中一株单抗7C4制备胶体金试纸条。本实验选择用1.8 mL1%柠檬酸三钠还原100 mL 0.01%氯金酸制备胶体金,经紫外可见光谱520 nm处扫描得知胶体金的粒径为18.41 nm。通过对影响胶体金标记的最佳pH、最佳标记蛋白量进行研究,结果为最佳pH为每毫升胶体金加入5μl的2 mol/L K2CO3,最佳抗体加入量每毫升胶体金中加入6μg浓度为1μg/μl的抗体。当金标抗体稀释3倍时,有最佳显色现象。组装胶体金试纸条的NC膜使用Sarturius CN 95,检测线上用浓度为0.4 mg/mL的诺氟沙星单克隆抗体包被,质控线用0.6 mg/mL的羊抗鼠二抗划线。所制得的胶体金试纸条的灵敏度为30 ng/mL。在牛奶和鱼肉的实际样品检测中,当样品中含有的NOR浓度大于50 ng/mL时可被检出。
邢广旭[7]（2013）在《氟喹诺酮类药物多残留免疫学检测技术研究》文中认为氟喹诺酮（fluoroquinolones, FQs）是第三代喹诺酮类药物，也是近20年来发展最快、研究最多的一类化学合成的抗生素，因其具有抗菌谱广、低毒、高效等特点,而广泛应用于人类临床与畜牧渔养殖业中。FQs类抗菌药为人兽共用药，动物体内药物残留通过食物链进入人体,对人类健康直接产生危害,可以导致细菌耐药性产生，并诱导癌变。因此，世界各国对FQs类抗菌药在动物源性食品中的残留制定了最高残留限量标准（10-1900μg/Kg）。由于FQs药物种类繁多，建立该类药物多残留检测方法有利于高效、快速的控制动物性产品质量安全，因此FQs药物多残留检测方法是目前的研究热点和趋势。基于此，本研究经过大量的试验，研制成功了FQs多残留检测试剂盒和胶体金免疫试纸。在分析FQs类药物分子结构和免疫原性基础上，采用二环己碳二亚胺（DCC）法将Nor（因Nor的结构是多种FQs类药物的母核结构）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）进行连接制备免疫抗原（Nor-BSA）和包被抗原（Nor-OVA）。并利用紫外扫描、SDS-PAGE电泳及动物免疫等方法进行鉴定。结果表明，动物免疫产生的多抗血清能和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应。结合紫外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定结果，证明Nor和载体蛋白成功偶联。为下一步FQs的抗体制备奠定了基础。用制备的Nor-BSA免疫新西兰大白兔，经过8次免疫后采血，采用间接ELISA测定多抗血清效价，阻断ELISA测定其敏感性及特异性。结果表明，兔多抗血清的效价在1:1.92×105至1:7.68×105之间；IC50最低为8.97μg/L；多抗血清能和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应。用制备的Nor-BSA免疫Balb/C小鼠，筛选出用于血清效价高的小鼠用于细胞融合，建立杂交瘤细胞株，利用杂交瘤细胞诱导腹水制备单抗并鉴定其性能。结果表明，共筛选出2株效价高、亲和力强的杂交瘤细胞1A3-D7和3E5-C6，染色体平均99条；制备的单抗亚型均为为IgG1/κ，腹水分别达到了1:2.56×105和1:1.024×106，Ka分别为3.63×109和3.86×109L/moL，3E5-C6产生的单抗IC50为5.50μg/L，单抗只和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应。基于所制备的FQs mAb，利用棋盘法确定FQs mAb、Nor-OVA及酶标抗体工作浓度，研制出FQs残留检测ELISA试剂盒并测定其性能。结果表明，所制备的两种ELISA试剂盒只和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应；经典阻断ELISA试剂盒的IC50为4.61μg/L，快速阻断ELISA试剂盒的IC50为6.27μg/L；两种试剂盒的准确度、精密度、保存期基本一致；与LC-MS-MS检测结果基本一致。基于所制备的FQs mAb，利用胶体金标记和膜免疫层析技术研制出FQs多残留检测试纸条并鉴定了其性能。结果表明，该试纸条对Nor和Pei的目测灵敏度为50ng/mL、对Lom的目测灵敏度为40ng/mL；试纸对Nor的机读灵敏度（B/B0＝80%）为2.519ng/mL、对Lom的机读灵敏度（B/B0＝80%）为1.533ng/mL、对Pei的机读灵敏度（B/B0＝80%）为2.394ng/mL；该试纸与其他抗生素无交叉反应；试纸检测50份阴性样品的假阳性率为0，检测72份阳性样品假阴性率为0；不同批次的试纸批内变异系数和批间变异系数均小于10%；试纸的有效期大于12个月；试纸的检测结果LC-MS-MS方法的检测结果基本一致。
刘彦政[8]（2013）在《氟喹诺酮类药物广谱单克隆抗体的制备及应用》文中研究说明氟喹诺酮类药物是一类化学合成的抗菌药，该类药物具有抗菌谱广，抗菌力强，作用迅速，吸收完全，且毒作用小等特点，因此该类药物广泛应用于人医及兽医临床。但是，随着此类药物的广泛应用，其在动物源性食品中的残留对人类身体健康产生了非常大的危害，引起了广泛的关注。本研究旨在建立一种多残留免疫分析方法对动物源性食品中氟喹诺酮类药物的残留进行检测。本研究对环丙沙星（CIP）和沙拉沙星（SAR）进行了分子改造，在它们分子结构中的哌嗪环上连接一个游离的氨基，合成四种新型半抗原（CIP1、CIP2、SAR1、SAR2）。然后，采用戊二醛法将合成的半抗原分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OA）连接，制备四种免疫原和四种包被原，半抗原与载体蛋白的结合比范围在12-17:1之间。以四种免疫原分别免疫Balb/c小鼠，利用间接ELISA方法评价不同的包被抗原与抗体组合，经过多次试验，表明环丙沙星的两种免疫原具有较好的免疫特性。选择血清效价最高且有明显抑制作用的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。通过间接竞争ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，采用有限稀释法经过多次筛选得到两株阳性杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生法产生腹水，以饱和硫铵法进行纯化，得到单克隆抗体。所得抗体能同时识别环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、达氟沙星、氧氟沙星、马波沙星、培氟沙星、洛美沙星、氨氟沙星和依诺沙星等12种氟喹诺酮类药物。以该抗体为基础，建立起一种检测12种氟喹诺酮类药物的ELISA方法。该法对上述药物的交叉反应率范围为23%-120%，IC50范围为7.6-39.5ng/mL，最低检测限（IC10）范围为1.0-4.5ng/mL。然后，选取8种兽用喹诺酮类药物分别在空白鸡肉中按照50、100ng/g的浓度添加，ELISA方法检测，添加回收率范围为61.5%-82.5%，变异系数为7.5%-15.2%。因此，本方法可以作为一种快速筛选工具用于动物源性食品中氟喹诺类药物的多残留检测，以提高检测效率，保障动物性食品安全。
刘娜[9]（2013）在《磺胺类及氟喹诺酮类药物兔单克隆抗体的制备与多残留检测技术研究》文中认为磺胺和氟喹诺酮类药物是感染性疾病的治疗药物,由于有促进动物生长、改善动物产品品质、降低动物发病率及死亡率等作用,常被作为饲料添加剂用于饲料中。但长期不合理使用这些人畜共用或与医用同源的药物作为饲料添加剂,可使机体内某些致病菌产生耐药性,从而降低了治疗效果并残留于动物性食品中,对人体健康造成危害,因此,开发快速、灵敏的检测技术对于动物性食品的质量控制,保障食品安全具有重要意义。本研究在总结前人工作经验的基础上探讨了将兔单克隆抗体技术用于检测磺胺和喹诺酮类多残留的可能性,合成了磺胺和喹诺酮类药物的人工抗原,通过抗原混和免疫,获得了免疫脾脏,运用杂交瘤技术分别制备了抗磺胺和抗氟喹诺酮药物残留的新型兔单克隆抗体SAs-80-8,FQs-111-2及FQs-31-3。建立了ELISA检测方法,构建了检测牛奶和猪尿样品中磺胺药物类残留的免疫金标检测方法,其主要研究结果如下：1、磺胺类免疫抗原通过SD、SMX分别与载体BSA重氮偶联生成SD-BSA、 SMX-BSA,合成的SMX-BSA和SD-BSA同时作为免疫抗原,采用混和免疫的方法免疫四只新西兰大白兔。合成磺胺母核结构TS,将其与载体OVA偶联合成包被抗原。通过血清筛选,选择血清效价较高的11421号兔子,取其脾脏进行细胞融合。2、兔子脾细胞与骨髓瘤细胞240E融合培养,初筛共获得122个阳性孔。复筛选择了9株细胞克隆进入亚克隆阶段。最终选择了杂交瘤细胞株80-8进行抗磺胺类药物单克隆抗体的生产。3、对抗体SAs-80-8的免疫学性质研究证实该抗体与四种磺胺药物有良好的竞争抑制作用,测得其对磺胺噻唑IC50值为0.68ng/mL,磺胺吡啶IC50值为1.15ng/mL,磺胺嘧啶IC50值为1.11ng/mL,磺胺甲恶唑IC50值为5.27ng/mL,对于四种磺胺药物混和物的IC50值为3.31ng/mL。猪尿及牛奶三个浓度的混合加标实验中,测得猪尿的回收率为92.6%-104.3%,牛奶的回收率为61.1%-81.6%,变异系数小于20%。4、应用兔单克隆抗体SAs-80-8,制备了四种磺胺类药物（磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲恶唑）的胶体金免疫试纸条,用于快速灵敏的定量分析。该试纸条对磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲恶唑四种药物的IC50值分别为5.19ng/mL、1.25ng/mL、0.66ng/mL与24.14ng/mL。加标牛奶中三个添加浓度回收率为78.02-135.10%,加标猪尿中三个添加浓度回收率为76.40-137.16%。建立的免疫胶体金方法与LC-MS/MS分析结果一致,证明了该方法可用于实际样品快速、准确的定量分析。5、选择氧氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹六种氟喹诺酮类小分子与BSA合成偶联物,通过混和免疫得到对多抗原的多抗血清,最终选择了11413号兔子的脾细胞进行融合。6、兔子脾细胞与240E骨髓瘤细胞融合培养,初筛共获得194个阳性孔复筛选取5株多克隆进行亚克隆。最终选择111-2、31-3杂交瘤细胞株分别生产抗氟喹诺酮药物和抗氧氟沙星药物的单克隆抗体。7、抗体FQs-111-2对六种氟喹诺酮类药物有良好的竞争抑制作用,对恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星六种药物的IC50值都小于10ng/mL,对诺氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星三种药物IC50值小于100ng/mL,对环丙沙星及洛美沙星两种药物IC50值小于200ng/mL。对于氟喹诺酮药物混和物的IC50值为0.32ng/mL的,最低检测限IC10值为0.10ng/mL。通过猪尿及牛奶三个浓度混和加标实验,测得猪尿的回收率53.44%-97.31%,变异系数3.32%-14.67%。牛奶的回收率93.07%-139.69%,变异系数2.32%-5.51%。抗体FQs-31-3对氧氟沙星有很好的竞争抑制作用,其IC50值为0.24ng/mL。对培氟沙星及氟罗沙星的IC50值分别为6.51ng/mL和0.99ng/mL。通过猪尿及牛奶中氧氟沙星药物的三个浓度的加标实验,测得猪尿的回收率61.12%-135.68%,变异系数3.31%-8.87%。牛奶的回收率76.10%-99.36%,变异系数在1.75%-9.73%。此外,还通过重组抗体生产技术获得了抗磺胺类药物的重组抗体,但其检测的灵敏度要低于之前通过杂交瘤技术所获得的抗体。
李彬彬[10]（2009）在《二氟沙星残留免疫学快速检测技术的研究》文中研究指明在分析二氟沙星（Difloxacin,DIF）分子结构和免疫原性基础上,运用单克隆抗体技术制备其单抗,并组装了竞争ELISA试剂盒和胶体金试纸。主要研究结果如下:1.二氟沙星人工抗原的制备与鉴定采用改进的碳二亚胺法,将半抗原二氟沙星（DIF）与载体牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联,,制备得到二氟沙星全抗原DIF-BSA和DIF-OVA。通过其紫外扫描光谱、SDS-PAGE凝胶电泳试验和免疫小鼠后抗血清的ELISA鉴定,表明半抗原和载体偶联成功,分子结合比分别为1:4.7和1:4.8,获得了高价、敏感、特异的抗血清。2.二氟沙星单克隆抗体的制备及免疫学鉴定用DIF-BSA免疫Balb/C小鼠3只,4次免疫后用间接ELISA和阻断ELISA选择出细胞融合备用小鼠1只,应用杂交瘤技术制备二氟沙星单克隆抗体（DIF mAb）,并对其效价、亲和力和特异性等进行鉴定。结果表明,筛选出1H10、2F12、4D8共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:5.12×102、1:3.2×101、1:2.56×102 ,腹水效价分别为1:2.56×105、1:1.28×105、1:6.4×104。同种亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a,亲和常数（Ka）分别为2.94×1010 L/moL、1.72×1010 L/moL和1.35×1010 L/moL.亲和力最高的1H10对DIF的IC50为15.6 ng/ml,单抗与其他氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应。通过试验获得高效价、敏感、特异的mAb,可用于动物性食品中DIF的残留检测的免疫学试验。3.二氟沙星残留免疫学快速检测方法的建立应用酶联免疫吸附试验原理,应用DIF mAb研制出DIF残留快速检测直接竞争ELISA试剂盒（DIF-Kit）, DIF-Kit的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,检测限为0.1 ng/ml,半数抑制浓度IC50为2.2 ng/ml,线性检测范围为1.0～128.0 ng/ml,平均批内和批间变异系数小于<15%。对牛奶、鸡肉分别添加0.4、2.0、10.0、50.0 ng/ml DIF标准品,平均回收率分别为89.3%和83.9%。DIF-Kit性能稳定,在4℃可保存6个月。依据胶体金免疫层析试验（GICA）原理,应用DIF mAb研制DIF残留快速检测免疫金标试纸（DIF-Strip）,DIF-Strip机读检测限为0.5 ng/ml,目测检测限为2.0 ng/ml。对牛奶添加2.0、4.0、8.0 ng/ml DIF标准品,回收率在94.5和107%之间,变异系数在1.6和9%之间。试剂盒对DIF残留检测可以在一个小时内完成,试纸条则可以在8到10分钟内完成。两种产品均具有快速、敏感、特异、简便等特点,可以广泛的用于对DIF残留的定性、半定量和定量检测。
二、二氟沙星人工抗原的合成与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、二氟沙星人工抗原的合成与鉴定（论文提纲范文）
（1）氟罗沙星噬菌体抗体库的构建及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 氟罗沙星人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.2.2 天然鼠源噬菌体抗体库的构建与淘筛 |
| 2.2.3 氟罗沙星单链抗体的表达、纯化与鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 氟罗沙星人工抗原的鉴定结果 |
| 3.1.1 抗原浓度检测 |
| 3.1.2 SDS-PAGE分析 |
| 3.1.3 紫外分光光度法检测 |
| 3.2 天然鼠源噬菌体单链抗体库构建的结果 |
| 3.2.1 RNA与cDNA超微量分光光度法测定的结果 |
| 3.2.2 VH与VL扩增的结果 |
| 3.2.3 VL导入linker的结果 |
| 3.2.4 重叠延伸PCR正式拼接ScFv的结果 |
| 3.2.5 ScFv的Sfi Ⅰ和Not Ⅰ双酶切结果 |
| 3.3 噬菌体抗体库鉴定的结果 |
| 3.3.1 三轮淘筛的库容量和噬菌体滴度计算结果 |
| 3.3.2 Phage-ELISA鉴定噬菌体抗体库 |
| 3.4 氟罗沙星单链抗体FLE-SCFV的鉴定结果 |
| 3.4.1 FLE-ScFv的Western-blot鉴定结果 |
| 3.4.2 FLE-ScFv纯化后的SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.4.3 FLE-ScFv的棋盘法鉴定效价ELISA结果 |
| 3.4.4 FLE-ScFv的间接竞争ELISA鉴定结果 |
| 3.4.5 FLE-ScFv的同源建模分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 氟罗沙星人工抗原的制备与鉴定 |
| 4.2 噬菌体抗体库的构建与淘筛 |
| 4.3 单链抗体FLE-ScFv的表达与鉴定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 噬菌体展示抗体库技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（2）动物源食品中氟甲喹快速免疫检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.1.1 动物性食品安全与兽药残留 |
| 1.1.2 氟甲喹概述 |
| 1.1.3 研究意义 |
| 1.2 喹诺酮类及氟甲喹检测方法的研究进展 |
| 1.2.1 喹诺酮类检测方法的研究进展 |
| 1.2.2 氟甲喹检测方法的研究进展 |
| 1.3 存在的主要问题 |
| 1.4 主要研究内容和方法 |
| 第二章 氟甲喹完全抗原合成及多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 缓冲溶液体系 |
| 2.1.3 仪器及设备 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 完全抗原的合成与鉴定 |
| 2.2.2 氟甲喹多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 完全抗原的合成与鉴定 |
| 2.3.2 氟甲喹多克隆抗体的制备及纯化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 氟甲喹残留的ELISA检测方法研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 缓冲溶液体系 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 包被原最适浓度和抗血清最适稀释度的确定 |
| 3.2.2 间接竞争ELISA反应体系条件的优化 |
| 3.2.3 间接竞争ELISA标准曲线的建立 |
| 3.2.4 ELISA方法的稳定性 |
| 3.2.5 抗体的特异性 |
| 3.2.6 样品的测定 |
| 3.2.7 ELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 包被原最适浓度和抗血清最适稀释度的确定 |
| 3.3.2 间接竞争ELISA反应体系条件的优化 |
| 3.3.3 间接竞争ELISA法标准曲线的建立 |
| 3.3.4 ELISA方法的稳定性 |
| 3.3.5 抗体的特异性 |
| 3.3.6 样品的测定 |
| 3.3.7 ELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 氟甲喹残留的固相膜免疫检测方法研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 仪器及设备 |
| 4.1.3 试验样品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 胶体金及金标抗体的制备 |
| 4.2.2 胶体金标记固相膜的制备 |
| 4.2.3 胶体金标记固相膜检测条件的优化 |
| 4.2.4 最低检出限的确定 |
| 4.2.5 样品的基质消除 |
| 4.2.6 样品的加标回收测定 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 胶体金的制备及质量鉴定 |
| 4.3.2 胶体金与FLU抗体结合最适pH值的确定 |
| 4.3.3 胶体金标记最佳抗体加入量的确定 |
| 4.3.4 胶体金标记固相膜检测条件的优化 |
| 4.3.5 最低检出限的确定 |
| 4.3.6 样品基质的消除 |
| 4.3.7 样品的加标回收测定结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 氟甲喹残留的仿生酶联免疫检测方法研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 药品及试剂 |
| 5.1.2 仪器及设备 |
| 5.1.3 实验样品 |
| 5.1.4 溶液体系的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 氟甲喹分子印迹膜(MIPs)的制备及表征 |
| 5.2.2 酶标抗原的制备 |
| 5.2.3 仿生酶联免疫分析方法的操作过程 |
| 5.2.4 BELISA反应体系条件的优化及方法的建立 |
| 5.2.5 样品检测 |
| 5.2.6 BELISA方法的验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 氟甲喹分子印迹膜的制备及表征 |
| 5.3.2 仿生酶联免疫分析方法的条件优化及建立 |
| 5.3.3 方法的特异性 |
| 5.3.4 样品测定 |
| 5.3.5 BELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.1.1 氟甲喹完全抗原的合成及多克隆抗体的制备 |
| 6.1.2 氟甲喹间接竞争ELISA检测方法的建立与应用 |
| 6.1.3 氟甲喹固相膜免疫检测方法的建立与应用 |
| 6.1.4 基于分子印迹技术的氟甲喹仿生酶联免疫检测方法的建立与应用 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 本研究的不足之处 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 附件 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）微囊藻毒素广谱性抗体晶体结构研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 微囊藻毒素的结构、危害及污染现状 |
| 1.1.1 微囊藻毒素的结构 |
| 1.1.2 微囊藻毒素的危害 |
| 1.1.3 微囊藻毒素国内外污染现状 |
| 1.2 微囊藻毒素检测方法研究进展 |
| 1.2.1 微囊藻毒素常见检测方法 |
| 1.2.2 微囊藻毒素广谱性免疫检测方法研究进展 |
| 1.3 抗体与小分子识别机制方法研究进展 |
| 1.3.1 广谱性抗体制备方法研究进展 |
| 1.3.2 交叉反应研究抗体-小分子识别机制 |
| 1.3.3 分子模拟研究抗体-小分子识别机制 |
| 1.3.4 定量构效关系研究抗体-小分子识别机制 |
| 1.3.5 同源建模研究抗体-小分子识别机制 |
| 1.3.6 结构生物学研究抗体-小分子识别机制 |
| 1.4 本研究目的意义及研究思路 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 研究内容与技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂与材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 标准溶液和常用缓冲液 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单克隆抗体核酸序列测定 |
| 2.2.2 单克隆抗体制备 |
| 2.2.3 腹水亚型测试 |
| 2.2.4 ic-ELISA检测腹水效价与抑制 |
| 2.2.5 单克隆抗体纯化 |
| 2.2.6 单克隆抗体SDS-PAGE电泳鉴定 |
| 2.2.7 抗体 Fab 片段制备 |
| 2.2.8 抗体 Fab 片段纯化 |
| 2.2.9 Fab片段肽指纹图谱及纯度、收率分析 |
| 2.2.10 ic-ELISA检测Fab片段效价抑制与特异性 |
| 2.2.11 LH-Fab与 Superdex75 填料结合机制分析 |
| 2.2.12 Fab片段晶体培养及结构解析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 单克隆抗体序列测定 |
| 3.2 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 微囊藻毒素抗体腹水效价与抑制测定 |
| 3.2.2 微囊藻毒素抗体腹水亚型鉴定 |
| 3.2.3 微囊藻毒素抗体腹水纯化 |
| 3.3 抗体 Fab 片段的制备及纯化 |
| 3.3.1 单克隆抗体的酶解 |
| 3.3.2 酶解产物纯化 |
| 3.3.3 Fab片段PMF鉴定及纯度、收率分析 |
| 3.3.4 Fab片段效价抑制检测及特异性分析 |
| 3.3.5 LH-Fab 与 16/60 Superdex 75 柱填料结合机制研究 |
| 3.4 Fab 片段结晶及结构解析 |
| 3.4.1 LH-Fab 片段晶体制备及结构解析 |
| 3.4.2 GAA-Fab 片段晶体制备及结构解析 |
| 3.5 Fab片段结构分析 |
| 3.5.1 LH-Fab结构分析 |
| 3.5.2 GAA-Fab结构分析 |
| 3.5.3 LH、GAA抗体结构对比及广谱性识别机制分析 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 LH-Fab制备 |
| 4.1.2 GAA-Fab制备 |
| 4.1.3 LH与GAA抗体广谱特异性识别差异分析 |
| 4.1.4 半抗原结构对抗体广谱性的影响 |
| 4.2 结论 |
| 4.3 创新点 |
| 4.4 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:攻读硕士学位期间发表论文与专利 |
（4）抗诺氟沙星单克隆抗体的制备及其性质的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验动物及骨髓瘤细胞 |
| 1.2 人工抗原制备与鉴定 |
| 1.3 小鼠免疫 |
| 1.4 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.5 腹水制备和抗体纯化 |
| 1.6 抗诺氟沙星单克隆抗体特性的鉴定 |
| 1.6.1 单克隆抗体细胞亚类鉴定 |
| 1.6.2 单克隆抗体效价的测定 |
| 1.6.3 单克隆抗体与载体蛋白的交叉反应性 |
| 1.6.4 单克隆抗体亲和力的测定 |
| 1.7 标准竞争曲线的绘制 |
| 1.8 NOR单抗与结构类似物的交叉反应性 |
| 2 结果 |
| 2.1 完全抗原偶联物的鉴定 |
| 2.2 小鼠免疫 |
| 2.3 杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.4 单克隆抗体性质的研究 |
| 2.4.1 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 2.4.2 单克隆抗体细胞效价的测定 |
| 2.4.3 单克隆抗体与载体蛋白的交叉反应性 |
| 2.4.4 SDS-PAGE鉴定纯化后的抗体 |
| 2.5 检测NOR的间接竞争ELISA方法的建立 |
| 2.5.1 包被抗原与单克隆抗体最佳工作浓度的测定 |
| 2.5.2 单克隆抗体的标准竞争曲线的绘制 |
| 2.5.3 单克隆抗体特异性测定 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）喹诺酮类药物广谱免疫分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 喹诺酮类药物结构特征 |
| 1.2 喹诺酮类药物免疫分析研究进展 |
| 1.2.1 特异免疫分析 |
| 1.2.2 广谱免疫分析 |
| 1.2.3 广谱特异性抗体制备存在问题 |
| 1.3 基于定量构效关系研究抗体与小分子识别机制进展 |
| 1.3.1 常见QSAR方法原理 |
| 1.3.2 QSAR在免疫分析中的应用进展 |
| 1.4 本研究目的意义及总体思路 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 研究内容与技术路线 |
| 第2章 吡哌酸为半抗原的广谱免疫分析研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 标准溶液和常用缓冲液 |
| 2.2.4 人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.2.5 动物的免疫与多克隆抗体的制备 |
| 2.2.6 酶联免疫分析方法 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.2.8 特异性评价 |
| 2.2.9 3D QSAR分析 |
| 2.2.10 吡哌酸在鸡蛋中的动态残留规律 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 人工抗原的合成与鉴定 |
| 2.3.2 ELISA优化 |
| 2.3.3 特异性评价 |
| 2.3.4 3D QSAR分析 |
| 2.3.5 添加回收 |
| 2.3.6 吡哌酸在鸡蛋中的动态残留规律 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 克林沙星为半抗原的广谱免疫分析研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 标准溶液和常用缓冲液的配制 |
| 3.2.4 抗原的制备与鉴定 |
| 3.2.5 动物的免疫与多克隆抗体的制备 |
| 3.2.6 荧光示踪物的合成与鉴定 |
| 3.2.7 标准曲线的建立 |
| 3.2.8 特异性评价 |
| 3.2.9 QSAR分析 |
| 3.2.10 样品前处理 |
| 3.2.11 添加回收 |
| 3.2.12 高效液相色谱法确证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 同源模式下建立克林沙星FPIA法 |
| 3.3.2 基于异源竞争检测模式检测羊奶中的克林沙星FPIA法 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 帕珠沙星为半抗原的广谱免疫分析研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 标准溶液和常用缓冲液 |
| 4.2.4 人工抗原的制备与鉴定 |
| 4.2.5 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.6 酶联免疫分析方法 |
| 5.2.7 数据处理 |
| 4.2.8 交叉反应 |
| 4.2.9 3D QSAR分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 人工抗原的合成与鉴定 |
| 4.3.2 抗体评价 |
| 4.3.3 ELISA优化 |
| 4.3.4 特异性评价 |
| 4.3.5 分子叠合 |
| 4.3.6 3D QSAR分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 半抗原结构对喹诺酮类抗体特异性和广谱性的影响 |
| 5.1.2 异源模式对检测性能的影响 |
| 5.2 结论 |
| 5.3 本研究创新点 |
| 5.4 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 作者攻读硕士学位期间科研成果情况 |
（6）诺氟沙星单克隆抗体的制备和胶体金试纸条的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 喹诺酮类的简述 |
| 1.1.1 喹诺酮类物质的发展 |
| 1.1.2 几种重要的喹诺酮类药物理化性质 |
| 1.1.3 喹诺酮类药物残留问题 |
| 1.1.4 喹诺酮类药物不良反应表现 |
| 1.1.5 喹诺酮类最大限量规定 |
| 1.1.6 喹诺酮药物的抗菌机制 |
| 1.2 喹诺酮类药物残留检测方法 |
| 1.2.1 微生物检测法 |
| 1.2.2 理化检测法 |
| 1.2.3 免疫分析法 |
| 1.2.4 生物传感器法 |
| 1.3 胶体金技术简介 |
| 1.3.1 胶体金 |
| 1.3.2 免疫快速诊断胶体金 |
| 1.3.3 胶体金免疫层析法在检测中的应用 |
| 1.3.4 胶体金技术的优缺点 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.4.1 诺氟沙星单克隆抗体的制备 |
| 1.4.2 诺氟沙星胶体金检测试纸条的研制 |
| 1.5 研究意义、创新点和技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 创新点 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第2章 NOR人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 诺氟沙星人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.2.1 透析袋的处理 |
| 2.2.2 诺氟沙星免疫抗原与包被抗原的制备 |
| 2.2.3 紫外光谱扫描鉴定 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.2.5 红外光谱扫描鉴定 |
| 2.2.6 人工抗原蛋白浓度的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 完全抗原电泳检测的结果 |
| 2.3.2 完全抗原紫外检测的结果 |
| 2.3.3 完全抗原红外检测的结果 |
| 2.3.4 测定完全抗原的浓度 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 诺氟沙星单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要设备 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 ELISA所需缓冲液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 间接ELISA法测定小鼠的效价 |
| 3.2.3 ELISA检测方法的优化 |
| 3.3 分泌抗NOR单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.1 细胞融合的有关细胞的准备 |
| 3.3.2 细胞融合及培养 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞的克隆 |
| 3.3.5 腹水制备 |
| 3.3.6 抗血清的纯化 |
| 3.3.7 抗诺氟沙星单克隆抗体特性的鉴定 |
| 3.3.8 标准竞争曲线的绘制 |
| 3.3.9 NOR单抗与结构类似物的交叉反应性 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 血清效价的测定 |
| 3.4.2 最佳羊抗鼠二抗浓度的确定 |
| 3.4.3 最佳检测抗原稀释度 |
| 3.4.4 抗诺氟沙星单克隆抗体的制备 |
| 3.4.5 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4.6 腹水制备 |
| 3.4.7 SDS-PAGE鉴定纯化后的抗体 |
| 3.4.8 单克隆抗体性质的测定 |
| 3.4.9 单克隆抗体亲和力的测定 |
| 3.4.10 标准曲线的绘制 |
| 3.4.11 单克隆抗体特异性测定 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 免疫动物选择 |
| 3.5.2 骨髓瘤细胞株的选择 |
| 3.5.3 细胞冻存 |
| 3.5.4 单克隆细胞克隆化 |
| 3.5.5 标准曲线的建立 |
| 3.5.6 交叉反应性 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 诺氟沙星胶体金试纸条的制备 |
| 4.1 实验试剂与材料 |
| 4.2 实验仪器与设备 |
| 4.3 溶液的配置 |
| 4.4 试验方法 |
| 4.4.1 胶体金的制备 |
| 4.4.2 胶体金质量的判定 |
| 4.4.3 胶体金标记蛋白抗体 |
| 4.4.4 金标抗体稀释度的选择 |
| 4.4.5 金标复溶液的选择 |
| 4.4.6 检测线T线、质控线C线浓度的确定 |
| 4.4.7 试纸条组装材料的选择 |
| 4.4.8 试纸条的组装 |
| 4.4.9 试纸条的检测方法和结果判断 |
| 4.4.10 试纸条灵敏度确定 |
| 4.4.11 交叉反应试验 |
| 4.4.12 稳定性试验 |
| 4.4.13 样品加标试验 |
| 4.5 结果与分析 |
| 4.5.1 胶体金的制备 |
| 4.5.2 胶体金的质量评价 |
| 4.5.3 胶体金标记抗体蛋白 |
| 4.5.4 金边探针活性鉴定 |
| 4.5.5 金标复溶液选择 |
| 4.5.6 金标抗体稀释度的确定 |
| 4.5.7 质控线、检测线的浓度确定 |
| 4.5.8 试纸条组装材料的选择 |
| 4.5.9 试纸条性能测试 |
| 4.5.10 样品添加实验 |
| 4.6 讨论 |
| 4.6.1 胶体金的制备 |
| 4.6.2 关于检测限 |
| 4.7 小结 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（7）氟喹诺酮类药物多残留免疫学检测技术研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1 FQS的分类 |
| 2 FQS的理化性质 |
| 3 FQS 的作用机制 |
| 4 FQS 的抗菌活性 |
| 5 FQS 的药代动力学特征 |
| 6 FQS 的不良反应 |
| 6.1 胃肠道反应 |
| 6.2 中枢神经系统 |
| 6.3 心脏毒性 |
| 6.4 光毒性 |
| 6.5 软骨毒性 |
| 6.6 其他不良反应 |
| 7 FQS 的限量标准 |
| 8 FQS 的检测方法 |
| 8.1 微生物法 |
| 8.2 高效液相色谱法 |
| 8.3 高效液相色谱-质谱联用 |
| 8.4 高效毛细管电泳 |
| 8.5 免疫学检测方法 |
| 第一章 氟喹诺酮类药物人工抗原的合成与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 紫外扫描鉴定结果 |
| 2.2 SDS-PAGE 鉴定结果 |
| 2.3 免疫原蛋白浓度测定结果 |
| 2.4 结果及分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 FQs 完全抗原制备方法 |
| 3.2 Nor-BSA 免疫 |
| 3.3 Nor 多抗血清的交叉反应 |
| 4 小结 |
| 第二章 氟喹诺酮类药物抗体的制备及其免疫学特性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 FQs pAb 鉴定 |
| 2.2 FQs mAb 杂交瘤细胞筛选 |
| 2.3 FQs mAb 鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鉴定 FQs Ab 免疫学特性包被原及抑制物的确定 |
| 3.2 FQs Ab 的免疫学特性鉴定 |
| 3.3 Balb/C 小鼠的超免方法 |
| 3.4 阳性细胞株的筛选 |
| 3.5 pAb 和 mAb 的比较 |
| 4 小结 |
| 第三章 氟喹诺酮类药物残留快速检测 ELISA 试剂盒的研制及性能测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 阻断 ELISA 试剂盒的研制及性能测定 |
| 2.2 快速阻断 ELISA 试剂盒的研制及性能测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 用于小分子半抗原的 ELISA 检测模式 |
| 3.2 ELISA 试剂盒的主要影响因素 |
| 3.3 FQs ELISA 试剂盒的制备 |
| 4 小结 |
| 第四章 氟喹诺酮类多残留免疫检测试纸条的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 胶体金的质量鉴定 |
| 2.2 胶体金标记 FQs mAb 最佳标记浓度 |
| 2.3 试纸性能测定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胶体金的制备 |
| 3.2 胶体金的制备注意事项 |
| 3.3 影响蛋白吸附于 NC 膜上的因素 |
| 3.4 多残留试纸结果的判定 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、攻读博士学位期间获奖及授权专利情况 |
| 二、攻读博士学位期间参编（译）论着和发表的文章 |
| 三、攻读博士学位期间主持及承担的项目 |
| 四、英文缩写词 |
| 五、常用试剂的配制 |
（8）氟喹诺酮类药物广谱单克隆抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 氟喹诺酮类药物概述 |
| 1.1.1 氟喹诺酮类药物的理化性质 |
| 1.1.2 氟喹诺酮类药物的代谢动力学 |
| 1.2 氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 |
| 1.2.1 主要分析方法 |
| 1.2.2 酶联免疫吸附法 |
| 1.3 人工抗原的制备方法 |
| 1.4 样品提取方法 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试剂与药品 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 主要溶液的配制 |
| 2.2.1 抗体纯化溶液 |
| 2.2.2 ELISA 所需溶液 |
| 2.2.3 细胞培养所需溶液 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 半抗原的合成 |
| 2.3.2 完全抗原的合成 |
| 2.3.3 抗原的鉴定 |
| 2.3.4 抗体的制备 |
| 2.3.5 杂交瘤细胞的制备 |
| 2.3.6 细胞融合 |
| 2.3.7 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.3.8 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.3.9 细胞培养上清液的测定 |
| 2.4 单克隆抗体的制备 |
| 2.4.1 单克隆抗体的纯化 |
| 2.4.2 细胞株稳定性检测 |
| 2.4.3 单克隆抗体的效价检测 |
| 2.4.4 特异性检测 |
| 2.4.5 交叉反应性检测 |
| 2.4.6 标准曲线的制作 |
| 2.4.7 样品提取 |
| 2.4.8 回收率测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗原鉴定 |
| 3.1.1 半抗原鉴定 |
| 3.1.2 完全抗原鉴定 |
| 3.1.3 半抗原/载体的结合比 |
| 3.1.4 偶联物浓度的测定 |
| 3.2 血清检测 |
| 3.2.1 血清效价 |
| 3.2.2 血清特异性 |
| 3.3 杂交瘤细胞株的建立与鉴定 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.2 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.3.3 单克隆抗体评价 |
| 3.3.4 标准曲线 |
| 3.3.5 添加回收率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 半抗原和免疫原 |
| 4.2 半抗原结合比 |
| 4.3 骨髓瘤细胞系的选择 |
| 4.4 细胞融合及细胞培养 |
| 4.5 抗体特性 |
| 4.6 ELISA 方法评价 |
| 4.7 样品提取及添加回收 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位论文期间发表论文情况 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）磺胺类及氟喹诺酮类药物兔单克隆抗体的制备与多残留检测技术研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 磺胺类药物简介 |
| 1.1 磺胺类药物结构及理化性质 |
| 1.2 磺胺类药物的作用机理 |
| 1.3 磺胺药物代谢 |
| 1.4 磺胺类药物危害 |
| 1.4.1 损伤泌尿系统 |
| 1.4.2 过敏反应 |
| 1.4.3 抑制造血系统 |
| 1.4.4 导致细菌产生抗药性 |
| 1.5 磺胺类药物的应用现状及限量标准 |
| 1.6 磺胺类药物多残留检测方法 |
| 1.6.1 磺胺药物的液相检测 |
| 1.6.2 色谱质谱联用 |
| 1.6.3 薄层色谱法 |
| 1.6.4 毛细管电泳法 |
| 1.6.5 免疫分析方法 |
| 2 氟喹诺酮类药物简介 |
| 2.1 氟喹诺酮类药物的结构及性质 |
| 2.2 氟喹诺酮类药物的作用机理 |
| 2.3 氟喹诺酮类药物的代谢 |
| 2.4 氟喹诺酮类药物危害 |
| 2.5 氟喹诺酮类药物的应用现状及限量标准 |
| 2.6 氟喹诺酮类药物多残留检测方法 |
| 2.6.1 徽生物法检测 |
| 2.6.2 液相色谱检测 |
| 2.6.3 色谱-质谱联用 |
| 2.6.4 高效毛细管电泳法 |
| 2.6.5 氟喳诺酮类的免疫分析方法 |
| 3 本课题的目的和意义 |
| 第二章 磺胺类药物人工抗原与多克隆抗体的制备 |
| 导言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器与材料 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 母核结构TS半抗原的合成与鉴定 |
| 2.2.2 人工抗原的制备 |
| 2.2.3 人工抗原浓度的测定 |
| 2.2.4 免疫抗原的鉴定及偶联率测定 |
| 2.2.5 兔子的免疫 |
| 2.2.6 多抗血清的获得、检测及兔子脾脏的筛选 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 人工半抗原TS合成鉴定 |
| 2.3.2 人工免疫抗原的鉴定 |
| 2.3.3 人工免疫蛋白质含量测定 |
| 2.3.4 多抗血清的筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 抗磺胺类药物兔单克隆抗体的制备及酶联免疫(ELISA)检测应用技术研究 |
| 导言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要设备与材料 |
| 3.1.3 溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞融合 |
| 3.2.2 融合细胞的培养与杂交瘤细胞的筛选及克隆 |
| 3.2.3 细胞筛选阶段ELISA检测筛选 |
| 3.2.4 兔单克隆抗体ELISA检测方法的建立与优化 |
| 3.2.5 SAs-80-8抗体免疫学性质的研究 |
| 3.2.6 样品测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞的筛选与克隆 |
| 3.3.2 ELISA条件的优化 |
| 3.3.3 RabMAb SAs-80-8抗体免疫学性质测定 |
| 3.3.4 样品回收率的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 磺胺类药物金标卡的制备与应用 |
| 导言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要设备 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 试剂及溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 玻璃器皿的准备 |
| 4.2.2 胶体金的制备 |
| 4.2.3 胶体金与抗体蛋白标记与纯化 |
| 4.2.4 金标试纸条的制作 |
| 4.2.5 试纸条上样条件确定 |
| 4.2.6 胶体金试纸条性质测定 |
| 4.2.7 样品测定 |
| 4.2.8 LC-MS/MS验证实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 胶体金与抗体结合比例的确定 |
| 4.3.2 免疫胶体金试纸条检测原理与结果判定 |
| 4.3.3 试纸条上样条件确定 |
| 4.3.4 试纸条的灵敏度及检测限 |
| 4.3.5 试纸条的特异性试验 |
| 4.3.6 样品检测试验 |
| 4.3.7 LC-MS/MS电喷雾离子源的设置及标准曲线 |
| 4.3.8 LC-MS/MS与LFA的比对 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 磺胺类药物重组抗体的制备 |
| 导言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞株与菌株 |
| 5.1.2 试剂及仪器 |
| 5.1.3 细胞的裂解及mRNA的提取 |
| 5.1.4 重链、轻链基因的PCR扩增及产物纯化 |
| 5.1.5 目的基因片段与载体的连接 |
| 5.1.6 质粒的转染与抗体的纯化 |
| 5.1.7 重组生产与杂交瘤生产的抗体性质比较 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 抗体重链与轻链的PCR扩增 |
| 5.2.2 质粒的酶切鉴定 |
| 5.2.3 重组质粒的测序 |
| 5.2.4 获得抗体的检测 |
| 5.2.5 重组生产与杂交瘤生产的抗体性质比较 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 氟喹诺酮类药物人工抗原与多抗的制备 |
| 导言 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 试剂 |
| 6.1.2 仪器及材料 |
| 6.1.3 溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 免疫抗原及包被抗原的合成 |
| 6.2.2 包被抗原及免疫抗原浓度的测定 |
| 6.2.3 免疫抗原的MALDI-TOFMS鉴定及偶联率测定 |
| 6.2.4 兔子的免疫 |
| 6.2.5 兔多抗血清的获得、检测及兔子脾脏的筛选 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 免疫抗原的MODI-TOFMS鉴定 |
| 6.3.2 免疫抗原偶联率 |
| 6.3.3 免疫抗原及包被抗原浓度的测定 |
| 6.3.4 多抗血清的筛选 |
| 第七章 氟喹诺酮类药物兔单克隆抗体的制备及酶联免疫(ELISA)检测技术研究 |
| 导言 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 主要试剂 |
| 7.1.2 主要设备与材料 |
| 7.1.3 溶液配制 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 细胞融合 |
| 7.2.2 融合细胞的培养与杂交瘤细胞的筛选及克隆 |
| 7.2.3 细胞筛选阶段ELISA检测筛选 |
| 7.3 FQs-111-2 ELISA检测方法的初步建立 |
| 7.3.1 免单克隆抗体111-2的优化 |
| 7.3.2 FQs-111-2抗体免疫学性质的研究 |
| 7.3.3 FQs药物回收率的测定 |
| 7.4 FQs-31-3 EL1SA检测方法的初步建立 |
| 7.4.1 兔单克隆抗体31-3优化 |
| 7.4.2 FQs-31-3抗体免疫学性质的研究 |
| 7.4.3 氧氟沙星药物ELISA回收率的测定 |
| 7.4.4 氧氟沙星胶体金试纸条 |
| 7.4.5 氧氟沙星LC-MS/MS确证 |
| 7.5 结果与分析 |
| 7.5.1 杂交瘤细胞的筛选与克隆 |
| 7.5.2 FQs-111-2抗体ELISA检测方法的初步建立 |
| 7.5.3 FQs-111-2抗体免疫学性质测定 |
| 7.5.4 FQs回收率测定 |
| 7.5.5 FQs-31-3抗体ELISA检测方法的初步建立 |
| 7.5.6 FQs-31-3抗体免疫学性质测定 |
| 7.5.7 氧氟沙星回收率的测定 |
| 7.5.8 氧氟沙星胶体金试纸条 |
| 7.6 讨论 |
| 第八章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的主要论文 |
（10）二氟沙星残留免疫学快速检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 二氟沙星的理化特性及临床应用 |
| 1.1.1 化学结构 |
| 1.1.2 抗菌机理 |
| 1.1.3 抗菌活性 |
| 1.1.4 药动学特点 |
| 1.1.5 临床应用 |
| 1.2 动物性食品中DIF 残留的检测方法 |
| 1.2.1 微生物学法 |
| 1.2.2 免疫分析法 |
| 1.2.3 色谱法 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 1.4 本研究的主要内容及技术路线 |
| 1.4.1 主要内容 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第2章 二氟沙星人工抗原的合成与鉴定 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 主要溶液 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 人工抗原的合成 |
| 2.2.2 人工抗原的鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 紫外扫描鉴定结果 |
| 2.3.2 SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定结果 |
| 2.3.3 动物免疫试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 关于人工抗原的合成 |
| 2.4.2 关于载体蛋白的选择 |
| 2.4.3 关于小分子人工抗原偶联的鉴定 |
| 2.4.4 关于动物免疫的方法 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 二氟沙星单克隆抗体的研制及其免疫学特性的鉴定 |
| 3.1 试剂与仪器 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 主要溶液 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 试验动物及细胞 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.2.2 DIF m Ab 的生产 |
| 3.2.3 DIFm Ab 的免疫学特性鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.2 DIF m Ab 免疫学特性鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于制备mAb 试验动物的选择 |
| 3.4.2 关于脾脏细胞与饲养细胞的制备 |
| 3.4.3 关于PEG 浓度的选择 |
| 3.4.4 关于杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4.5 关于杂交瘤细胞株的克隆化 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 二氟沙星残留直接竞争ELISA 试剂盒的研制 |
| 4.1 试剂与溶液 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 主要溶液 |
| 4.1.3 杂交瘤细胞及DIF mAb |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 DIF-Kit 的研制 |
| 4.2.2 DIF-Kit 的的操作步骤及结果判定 |
| 4.2.3 样品的预处理 |
| 4.2.4 DIF-Kit 性能的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 DIF m Ab 与HRP-DIF 最佳工作浓度的确定结果 |
| 4.3.2 直接竞争ELISA 标准曲线的绘制 |
| 4.3.3 灵敏度鉴定结果 |
| 4.3.4 特异性鉴定结果 |
| 4.3.5 准确度鉴定结果 |
| 4.3.6 精密度鉴定结果 |
| 4.3.7 基质效应性鉴定结果 |
| 4.3.8 稳定性鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于酶标半抗原的制备 |
| 4.4.2 关于DIF mAb 和HRP-DIF 最佳工作浓度的确定 |
| 4.4.3 关于样品的预处理 |
| 4.4.4 关于DIF-Kit 质量的特性 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 二氟沙星残留快速检测免疫金标试纸的研制 |
| 5.1 试剂与仪器 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 DIF m Ab 的纯化 |
| 5.2.2 胶体金的制备 |
| 5.2.3 金标抗体的制备 |
| 5.2.4 免疫层析试纸条的制备 |
| 5.2.5 试纸条性能的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 胶体金质量的鉴定结果 |
| 5.3.2 敏感性的鉴定结果 |
| 5.3.3 特异性鉴定结果 |
| 5.3.4 准确度与精密度鉴定结果 |
| 5.3.5 保存期检验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 关于柠檬酸三钠用量的确定 |
| 5.4.2 关于胶体金颗粒大小的性质 |
| 5.4.3 关于胶体金PH 值的调整 |
| 5.4.4 关于膜材料的选择 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
四、二氟沙星人工抗原的合成与鉴定（论文参考文献）
- [1]氟罗沙星噬菌体抗体库的构建及鉴定[D]. 杜加茹. 郑州大学, 2020
- [2]动物源食品中氟甲喹快速免疫检测技术的研究[D]. 刘卫华. 河北农业大学, 2019(01)
- [3]微囊藻毒素广谱性抗体晶体结构研究[D]. 焦文阳. 华南农业大学, 2019(02)
- [4]抗诺氟沙星单克隆抗体的制备及其性质的研究[J]. 徐田丽,苏国成,江晓颖,孙雪珂,江峰. 科技风, 2017(12)
- [5]喹诺酮类药物广谱免疫分析研究[D]. 陈佳虹. 华南农业大学, 2016(03)
- [6]诺氟沙星单克隆抗体的制备和胶体金试纸条的研制[D]. 徐田丽. 集美大学, 2016(05)
- [7]氟喹诺酮类药物多残留免疫学检测技术研究[D]. 邢广旭. 河南农业大学, 2013(03)
- [8]氟喹诺酮类药物广谱单克隆抗体的制备及应用[D]. 刘彦政. 河北农业大学, 2013(03)
- [9]磺胺类及氟喹诺酮类药物兔单克隆抗体的制备与多残留检测技术研究[D]. 刘娜. 浙江大学, 2013(06)
- [10]二氟沙星残留免疫学快速检测技术的研究[D]. 李彬彬. 河南科技大学, 2009(07)