P-VP8*IgY抗轮状病毒的药效学评价及诺如病毒小动物模型的初步探索

论文摘要

诺如病毒（Norovirus,NoV）和轮状病毒（Rotavirus,RV）是导致全球病毒性腹泻最主要的病原体,造成了严重的社会公共卫生问题,但迄今为止尚没有特异性抗NoV药物和疫苗,更没有任何一种特异性药物可以同时防治NoV和RV感染。2005年Jiang等人利用大肠杆菌表达系统成功表达出诺如病毒P颗粒。P颗粒具有与NoV病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）相似的免疫原性及与HBGAs受体结合的能力。P颗粒可在大肠杆菌表达系统中稳定、高效表达,且具有成本低、周期短的特点,可广泛用于NoV发病机制、抗原变异、分子进化及第二代亚单位候选疫苗等研究。研究发现诺如病毒P颗粒具有八面体结构,且每个面均含有3个环形结构（loopl,loop2,loop3）,均暴露于P蛋白表面,适合外源表位的插入,且不会影响P颗粒的形成和产量。由于每个P蛋白表面均可插入抗原表位,且把外源片段暴露在最外端,极大的增强了抗原的免疫原性,可作为非常理想的抗原提呈平台。本课题组将轮状病毒的外壳刺突样蛋白VP8*基因片段插入到诺如病毒P颗粒的表面环形区域loop2,在大肠杆菌中稳定表达出嵌合VP8*的P-VP8*蛋白,经免疫来航鸡制备纯化出特异性P-VP8*IgY,研究证实P-VP8*IgY能有效阻断NoV与HBGAs受体结合,并对RV Wa株感染MA104细胞具有抑制作用,表明P-VP8*lgY有望成为一种有前景的抗诺如和轮状病毒的双价抗体药物制剂。本研究在前期工作基础上,利用轮状病毒感染乳鼠疾病动物模型,进一步评价P-VP8*IgY抗轮状病毒的体内保护作用,具体方法与结果如下:48只SPF级乳鼠随机分为对照组、感染组、预防组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组,每组8只。利用107PFU体外培养的ZTR-68株RV（GIP[8]型）灌胃攻毒6日龄乳鼠,建立RV感染乳鼠动物模型。低中高剂量组连续3天分别给予不同浓度的P-VP8*IgY（3.3mg·kg-1、10mg·kg-1、30mg·kg-1）,预防组于攻毒前2天给予一定量的P-VP8*IgY（20mg·kg-1）观察给药后乳鼠症状和腹泻情况,并用轮状病毒胶体金检测试剂盒检测乳鼠粪便轮状病毒抗原;ELISA法检测粪便RV抗原,RT-qPCR检测小肠组织RV基因拷贝数,Western Blot检测RV蛋白的表达水平,HE染色观察小肠组织病理改变,以及IHC检测小肠组织RV表达。结果显示6日龄昆明乳鼠灌胃攻毒107PFU ZTR-68株轮状病毒后全部出现黄色稀水样便,可成功制备乳鼠RV感染模型:治疗3d后,中剂量治疗组、高剂量治疗组与感染组比较腹泻程度明显缓解,腹泻评分（分别为1.75±0.49,1.50±0.27）与感染组（3.37±0.18）比较显著降低（P<0.05）、粪便RV抗原含量（分别为60.0±26.2、40.0±18.5）与IG（130.0±41.4）相比较明显减少（P<0.05）,小肠组织中RV基因拷贝数和RV-VP6蛋白表达显著减少（P<0.05）,小肠组织病理显示绒毛空泡样改变减轻,IHC显示RV抗原表达量显著降低。预防组和低剂量治疗组与感染组比较差异无显著性。结论:P-VP8*lgY可中和RV感染乳鼠中肠道及小肠组织中RV抗原,保护小肠绒毛,从而缓解腹泻症状,起到抗RV的作用。诺如病毒P颗粒的抗原性远大于VP8*蛋白,理论上P-VP8*IgY具有较好的抗诺如病毒的作用,前期已经通过国际上公认的HBGAs受体体外替代中和实验证实P-VP8*IgY能阻断诺如病毒与HBGAs受体结合,因此有必要进行P-VP8*IgY体内抗诺如病毒的效果评价。由于诺如病毒缺乏有效的小动物模型,本研究第二部分旨在首次探索建立树駒诺如病毒感染疾病动物模型,具体方法和结果如下:15只6月龄树駒被随机分为A、B、C3组,每组5只,每只树駒灌服500 uL 100mM NaHCO3溶液中和胃酸处理后进行灌胃攻毒:A、B两组分别灌服1ml HuNoVsGII.4型2010和Sydney株的粪便悬液（病毒载量约2X105viral RNA copies）,C组灌服1000uLPBS作为对照。攻毒后连续7天观察体征和腹泻症状,每隔24h采集粪便应用RT-PCR法检测HuNoVs RNA,处死树駒后采集小肠组织,HE染色观察病理变化并应用免疫组化法检测病毒抗原,并对树齣唾液进行HBGAs鉴定分析。结果显示树駒经HuNoVs灌胃攻毒后未出现明显腹泻等感染症状,粪便标本中未检测到HuNoVs RNA,小肠组织中未检测到HuNoVs抗原,病理变化不明显,树齣唾液中HBGAs抗原为阴性。结论:树齣对HuNoVs不易感原因可能与其不分泌表达HBGAs和普通级饲养繁殖条件等有关,HuNoVs感染小动物模型仍有待进一步探索。结论:1、P-VP8*lgY可中和RV感染乳鼠粪便及小肠组织中的RV抗原,保护小肠绒毛,从而缓解腹泻症状,起到抗轮状病毒的作用,为P-VP8*IgY的进一步开发提供了基础,也为传统中药鸡子黄的现代应用提供新方向。2、在国内首次进行了诺如病毒树齣疾病动物模型的探索,证实树駒对诺如病毒不易感,并可能与其不分泌表达HBGAs和普通级饲养繁殖条件等有关,为今后建立HBGAs遗传成分稳定的诺如病毒小动物模型提供新方向。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景
•   第一节 诺如病毒P颗粒
•     1.1 诺如病毒基因组学
•     1.2 诺如病毒P颗粒的发现
•     1.3 基于P颗粒的疫苗平台
• *蛋白的发现'>  第二节 轮状病毒基因组学及P-VP8^*蛋白的发现
• *IgY的工作基础'>  第三节 IgY及P-VP8^*IgY的工作基础
•     3.1 IgY
• * IgY的工作基础'>    3.2 P-VP8^*IgY的工作基础
•   第四节 诺如病毒树鼩小动物模型探索的可行性
•   第五节 本研究的目的、方法及意义
• 第二章 实验研究
• *IgY防治乳鼠轮状病毒感染性腹泻的药效学研究'>  第一部分 P-VP8^*IgY防治乳鼠轮状病毒感染性腹泻的药效学研究
•     1 材料
•     2 方法
•     3 结果
•     4 讨论
•   第二部分 诺如病毒感染树鼩小动物模型的初步探索
•     1 材料
•     2 方法
•     3 结果
•     4 讨论
• 第三章 全文总结
• 参考文献
• 综述:诺如病毒HBGAs受体阻断剂研究进展
•   参考文献
• 硕士期间取得的成果
•   硕士期间参与发表的论文
•   硕士期间参与的课题
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭伦爱

导师: 张绪富,戴迎春

关键词: 人源轮状病毒,药效学,人诺如病毒,树鼩

来源: 南方医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 南方医科大学

基金: 特异性IgY微胶囊防治诺如,轮状病毒腹泻的成药性研究.广州市科技计划项目产学研协同创新重大专项民生科技研究专题(编号:201604020111),基于HIES模型的HuNOV内吞机制及涩肠止泻中药的干预作用研究.国家自然科学基金(编号:81773975)

分类号: R392

总页数: 92

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