导读:本文包含了肝细胞胆管侧细胞膜论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:胆汁淤积性肝病,溶酶体相关膜蛋白2,多药耐药相关蛋白2,肝细胞胆管膜
肝细胞胆管侧细胞膜论文文献综述
蔡维乐[1]（2017）在《LAMP2参与调控MRP2在肝细胞胆管侧细胞膜定位的机制研究》一文中研究指出胆汁淤积性肝病是由肝脏内外原因导致胆汁生成或排泄障碍引发胆汁在肝脏中堆积,造成肝脏损害的一类疾病,临床上认为ALP超过正常上限1.5倍,且GGT超过正常上限3倍,可诊断胆汁淤积性肝病[1],目前关于胆汁淤积性肝病的治疗都基于病因解除,但对于一些致病机制不清楚的胆汁淤积性肝病例如PBC,PSC等,并没有较好的治疗药物。因此了解胆汁淤积的发病机制对于寻找这些疾病有效的治疗药物有着重要的意义,本课题组前期利用PBC患者胆管侧细胞膜做免疫原,通过单克隆抗体制备获得一株单抗mAb1F9,经过鉴定该抗体识别的是溶酶体相关膜蛋白2即LAMP2分子。课题组前期研究发现LAMP2在胆汁淤积患者血清中明显升高,且UDCA治疗后叁个月血清中LAMP2的变化可以用来评判PBC患者是否对UDCA应答。同时利用TALENs技术成功构建了LAMP2全身敲除大鼠,发现LAMP2敲除大鼠发生了胆汁淤积的表型,且肝脏组织中与胆汁排泄相关的转运分子MRP2定位发生改变。这些结果提示LAMP2和胆汁排泄有密切关系,但是LAMP2是如何参与胆汁排泄和影响转运分子MRP2的定位呢?我们将通过以下实验进行探索。研究内容1.鉴于LAMP2敲除大鼠为全身基因敲除大鼠并出现全身性疾病,为判断敲除大鼠组织中MRP2分子的定位改变是否由LAMP2直接引起还是全身疾病的并发症,我们将从大鼠原代细胞层面来观察LAMP2对MRP2分子定位的影响。首先我们利用胶原酶灌注法将大鼠原代细胞分离出来,再用胶原叁明治培养方法培养肝细胞,观察胆管形成过程,待其胆管结构稳定时再利用细胞免疫荧光技术观察MRP2在LAMP2敲除大鼠和对照组中的定位。为了检测原代肝细胞中MRP2的转运功能如何,我们利用直接免疫荧光法观察MRP2对其荧光底物CMFDA的转运效能。通过观察细胞内和胆管侧荧光强度值来评价MRP2的转运功能。2.为了更好的探索LAMP2对MRP2的影响,我们选择了能够形成胆管的肝癌细胞系HepG2进行体外研究,用LAMP2-siRNA慢病毒感染细胞构建LAMP2下调的细胞系,利用qRT-PCR和Western blot技术检测敲减效率。然后通过免疫荧光观察胆管的形态、数量和各极性分子的定位,利用CD59转吞实验(transcytosis)观察细胞间接转运途径,最后通过间接免疫荧光法观察MRP2与初级内体标志物EEA1的共定位情况,以了解异常定位的MRP2储存在哪里。3.为了观察LAMP2各个亚型对MRP2分子的定位影响。我们利用craspre基因编辑技术构建LAMP2A,LAMP2B敲除的HepG2细胞系,并通过Western blot和qRT-PCR,普通PCR,对细胞进行鉴定,细胞鉴定成功后通过免疫荧光法观察MRP2的定位是否发生改变。研究结果1.将大鼠原代细胞分离出来后,用胶原叁明治培养法培养细胞,在加入胶原后细胞慢慢形成小的胆管,随着培养时间的延长可以看到肝细胞胆管形成越来越多而且结构也越稳定,在第五天时我们比较了敲除大鼠原代肝细胞与对照组相比胆管形成数量和胆管形态并没有明显差异,但是MRP2的定位却发生了改变,表现为在敲除大鼠原代肝细胞中不仅在胆管膜上有定位,而在细胞内也弥散了大量的MRP2存在,而对照组几乎完全定位在胆管膜上。同时对MRP2的转运功能检测发现,正常大鼠肝细胞可以将细胞内的CMFDA很快的转运到胆管侧,而敲除LAMP2后肝细胞内储存大量CMFDA不能排出,这表明敲除LAMP2后肝细胞MRP2分子转运功能受限。2.利用LAMP2-siRNA慢病毒我们成功构建LAMP2敲减的HepG2细胞系,我们发现敲减LAMP2后对HepG2的胆管形成数量没有差异,但是胆管形态却发生了改变。同时发现在下调LAMP2后MRP2的定位也发生了改变,表现为MRP2几乎都弥散在细胞内,而对照组细胞MRP2基本都定位在细胞胆管膜上,不仅如此,LAMP2下调后也引起了其他极性分子MDR1、BSEP定位的改变,而这些分子与MRP2都是通过直接运输途径插入(insertion)到胆管膜上,随后我们观察了通过间接通路上膜的分子CD59,发现下调LAMP2后也引起了该分子的运输障碍,这提示我们LAMP2是影响了细胞内分子运输机制才导致MRP2的定位改变。我们还发现异常定位的MRP2大量的储存在初级内体中。这提示LAMP2影响肝细胞内分子运输可能是通过影响细胞内体融合功能。3.经过Western blot和qRT-PCR,普通PCR技术验证,我们成功构建了LAMP2A、LAMP2B敲除的HepG2细胞系,随后发现两种亚型敲除的细胞系都引起了MRP2定位的改变。结论1.本实验通过体外大鼠原代肝细胞实验确定了LAMP2确实参与调控了MRP2在胆管膜上的正确定位,并且会影响MRP2转运功能的正常发挥,从而引起胆汁排泄障碍,2.进一步通过人源性肝癌细胞系HepG2进行研究发现LAMP2参与调控了肝细胞内分子运输系统机制,进而导致MRP2定位异常,而这种调控可能是通过影响肝细胞内体融合功能而导致。3.我们成功构建了LAMP2分子的亚型LAMP2A、LAMP2B分别敲除的HepG2细胞系并且两个亚型都对MRP2的定位产生影响。(本文来源于《第四军医大学》期刊2017-05-01）
王敬博[2]（2007）在《肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的筛选与鉴定》一文中研究指出肝内胆汁淤积是多种肝病的重要病理改变,其可以加重肝脏损害,加速肝硬化、肝功能衰竭的进程。在临床实践中发现,各种原因导致的肝炎患者一旦合并有肝内胆汁淤积,则病情进展速度加快,短期内即可进展到肝硬化期,甚至发展为重症肝炎,肝功能衰竭而死亡,治疗上非常困难,常无有效的治疗措施。目前研究认为,肝脏对代谢产物或异物的排泄是通过分布在肝细胞胆管膜侧的转动体来完成的,这种转运是耗能的,需要ATP的参与。这被认为是代谢产物或异物排出肝细胞的终末环节。有学者也将这一环节称为肝细胞的第Ⅲ相反应。第Ⅲ相反应异常可能是肝内胆汁淤积性肝病最重要的发病机制。因此,肝细胞胆管侧细胞膜胆汁排泄相关分子的研究也成为肝内胆汁淤积性肝病领域的研究热点。近年来,虽然在肝细胞胆管侧细胞膜陆续发现了一些与胆汁排泄相关的分子,明确了一些疾病的病因及发病机制,使一些肝内胆汁淤积疾病得到了及时诊断及治疗,然而,发现的这些分子还远不能解决所有肝内胆汁淤积性肝病的问题。因此,建立具有功能的肝细胞胆管膜侧体外转运模型,发现肝细胞胆管侧细胞膜上新的转运相关分子,对于进一步明确肝脏的复杂生理功能及肝内胆汁淤积性肝病发病机理至关重要。实验目的:分离肝细胞胆管侧细胞膜和血窦侧细胞膜,建立具有功能的肝细胞胆管膜侧体外转运模型,筛选与鉴定大鼠肝细胞胆管侧细胞膜上转运相关分子。材料和方法:1.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜的提取与鉴定(1)以percoll和蔗糖溶液为密度梯度介质,利用密度梯度离心法分离大鼠肝细胞胆管侧膜小体(CMV)和血窦侧膜小体(SMV);(2)通过SDS-PAGE、酶学分析和透射电镜扫描对之性质进行进一步鉴定;(3)以Mrp2特异性转运物质E217βG为转运底物,利用转运试验观察CMV的转运活性。2.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子抗体的筛选(1)以大鼠肝细胞胆管侧膜小体为免疫原,免疫BALB/C小鼠,进行单克隆抗体的制备;(2)利用比较ELISA法、免疫组化和体外转运试验筛选抗大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的抗体;(3)用腹水制备法大量制备单克隆抗体,并用饱和硫酸铵法进一步纯化抗体;(4)利用抗体亚类和亚型检测试剂盒对抗体进行亚类和亚型的检测;(5)利用Western blot对筛选到的抗体所识别的目的蛋白进行分子量的鉴定。3.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的抗原鉴定(1)利用双向电泳,进一步鉴定抗体所识别抗原的理化性质;(2)利用免疫沉淀,双向电泳,Western blot等技术获取抗体所识别抗原的蛋白条带;(3)利用肽指纹图谱测序,数据库软件分析的方法分析蛋白条带,初步明确抗体所识别抗原的蛋白质信息。结果:1.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜的提取与鉴定情况以percoll和蔗糖溶液为密度梯度介质,利用密度梯度离心法成功地提取出了大鼠肝细胞胆管侧膜小体(CMV)和血窦侧膜小体(SMV),SDS-PAGE结果显示:分离的肝细胞膜蛋白与肝细胞匀浆蛋白存在着明显蛋白条带的差异;同时肝细胞胆管侧细胞膜和血窦侧细胞膜也有一些蛋白条带的不同。碱性磷酸酶是肝细胞胆管侧细胞膜的标志物,Na+-K+ ATPase则是肝细胞血窦侧细胞膜的标志物。碱性磷酸酶和Na+-K+ ATPase特异性酶学分析显示:CMV的碱性磷酸酶活性是SMV的5.2倍,而SMV的Na+-K+ ATPase活性是CMV的5.7倍,有显着统计学差异。透射电镜扫描:CMV和SMV,为大小均一,直径约450nm的膜性囊泡。体外转运实验证实:分离得到的CMV具有转运活性。2.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子抗体的筛选以提取的大鼠肝细胞胆管侧膜小体为免疫原,免疫BALB/C小鼠,通过多次融合,利用比较ELISA法、获得了46株在大鼠肝细胞胆管侧细胞膜高表达分子的单克隆抗体。免疫组化组织定位结果显示:所得到的46株抗体在大鼠肝组织中的表达分布不尽相同。其中一株单克隆抗体特异性地定位于大鼠肝细胞胆管侧细胞膜上,命名为cm1,抗体亚类和亚型为IgG2a/κ型。Western blot定量分析,也证实其在肝细胞胆管侧细胞膜表达量明显高于血窦侧细胞膜的表达量,其所识别抗原的分子量约为140kDa。另外,有两株抗体在肝组织中表达呈特异性分布。一株抗体在大鼠肝小叶中央静脉周围肝实质细胞中的表达明显高于在肝小叶的汇管区周围肝实质细胞中的表达,命名为cv1;有趣的是cv1在人肝脏组织中表达在肝细胞的血窦侧细胞膜上以及肝血窦腔某种肝非实质细胞中,而在人和鼠肝组织中其所识别抗原的分子量均约为25kDa。另一株抗体特异性地表达在肝细胞核膜上,命名为nm1,其所识别抗原的分子量约为50kDa。有关这46株抗体的体外转运功能筛选还在进一步的进行中。3.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的抗原鉴定我们首先对cm1、cv1和nm1这3株抗体所识别的抗原进行了进一步的鉴定。免疫沉淀、肽指纹图谱测序结果提示:cm1可能是一种新的表达在大鼠肝细胞胆管侧细胞膜上的特异性分子。双向电泳、Western blot结果显示,cv1识别抗原的等电点约为3-4;nm1抗体所识别的抗原为ATP合成亚单位β(ATPB)。结论:我们首次在国内利用密度梯度离心法成功分离出了大鼠肝细胞胆管侧细胞膜和血窦侧细胞膜,建立了具有功能的肝细胞胆管膜侧体外转运模型。该模型的建立,为进一步明确已知转运相关分子的生理功能及发现新的转运相关分子提供了有利的工具和手段,随着该模型的广泛应用,将为进一步明确肝脏复杂的生理功能及肝内胆汁淤积性肝病的发病机制奠定良好的基础。利用提取的大鼠肝细胞胆管侧膜小体为免疫原,通过比较ELISA法,筛选获得了46株在大鼠肝细胞胆管侧细胞膜高表达分子的单克隆抗体。其中,一株单抗特异性地结合在肝细胞胆管膜侧,我们将其命名为cm1,经免疫沉淀及肽指纹质谱测序,与已知转运分子进行比较分析,推测其可能为转运相关的新分子。第二株单抗,特异性地结合在大鼠肝小叶中央静脉周围肝实质细胞胞浆中,呈明显的区域分布差异,将其命名为cv1。有趣的是:cv1在人类表达在肝细胞的血窦侧细胞膜上,它们所识别抗原的分子量均约为25kDa,这种种属表达部位差异的分子还未见相关报道,推测其可能也为一个新分子。第叁株单抗特异性地识别肝细胞核膜,将其命名为nm1。抗原鉴定结果显示:nm1抗体所识别的抗原为ATP合成亚单位β(ATPB)。(本文来源于《第四军医大学》期刊2007-04-01）
肝细胞胆管侧细胞膜论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
肝内胆汁淤积是多种肝病的重要病理改变,其可以加重肝脏损害,加速肝硬化、肝功能衰竭的进程。在临床实践中发现,各种原因导致的肝炎患者一旦合并有肝内胆汁淤积,则病情进展速度加快,短期内即可进展到肝硬化期,甚至发展为重症肝炎,肝功能衰竭而死亡,治疗上非常困难,常无有效的治疗措施。目前研究认为,肝脏对代谢产物或异物的排泄是通过分布在肝细胞胆管膜侧的转动体来完成的,这种转运是耗能的,需要ATP的参与。这被认为是代谢产物或异物排出肝细胞的终末环节。有学者也将这一环节称为肝细胞的第Ⅲ相反应。第Ⅲ相反应异常可能是肝内胆汁淤积性肝病最重要的发病机制。因此,肝细胞胆管侧细胞膜胆汁排泄相关分子的研究也成为肝内胆汁淤积性肝病领域的研究热点。近年来,虽然在肝细胞胆管侧细胞膜陆续发现了一些与胆汁排泄相关的分子,明确了一些疾病的病因及发病机制,使一些肝内胆汁淤积疾病得到了及时诊断及治疗,然而,发现的这些分子还远不能解决所有肝内胆汁淤积性肝病的问题。因此,建立具有功能的肝细胞胆管膜侧体外转运模型,发现肝细胞胆管侧细胞膜上新的转运相关分子,对于进一步明确肝脏的复杂生理功能及肝内胆汁淤积性肝病发病机理至关重要。实验目的:分离肝细胞胆管侧细胞膜和血窦侧细胞膜,建立具有功能的肝细胞胆管膜侧体外转运模型,筛选与鉴定大鼠肝细胞胆管侧细胞膜上转运相关分子。材料和方法:1.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜的提取与鉴定(1)以percoll和蔗糖溶液为密度梯度介质,利用密度梯度离心法分离大鼠肝细胞胆管侧膜小体(CMV)和血窦侧膜小体(SMV);(2)通过SDS-PAGE、酶学分析和透射电镜扫描对之性质进行进一步鉴定;(3)以Mrp2特异性转运物质E217βG为转运底物,利用转运试验观察CMV的转运活性。2.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子抗体的筛选(1)以大鼠肝细胞胆管侧膜小体为免疫原,免疫BALB/C小鼠,进行单克隆抗体的制备;(2)利用比较ELISA法、免疫组化和体外转运试验筛选抗大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的抗体;(3)用腹水制备法大量制备单克隆抗体,并用饱和硫酸铵法进一步纯化抗体;(4)利用抗体亚类和亚型检测试剂盒对抗体进行亚类和亚型的检测;(5)利用Western blot对筛选到的抗体所识别的目的蛋白进行分子量的鉴定。3.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的抗原鉴定(1)利用双向电泳,进一步鉴定抗体所识别抗原的理化性质;(2)利用免疫沉淀,双向电泳,Western blot等技术获取抗体所识别抗原的蛋白条带;(3)利用肽指纹图谱测序,数据库软件分析的方法分析蛋白条带,初步明确抗体所识别抗原的蛋白质信息。结果:1.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜的提取与鉴定情况以percoll和蔗糖溶液为密度梯度介质,利用密度梯度离心法成功地提取出了大鼠肝细胞胆管侧膜小体(CMV)和血窦侧膜小体(SMV),SDS-PAGE结果显示:分离的肝细胞膜蛋白与肝细胞匀浆蛋白存在着明显蛋白条带的差异;同时肝细胞胆管侧细胞膜和血窦侧细胞膜也有一些蛋白条带的不同。碱性磷酸酶是肝细胞胆管侧细胞膜的标志物,Na+-K+ ATPase则是肝细胞血窦侧细胞膜的标志物。碱性磷酸酶和Na+-K+ ATPase特异性酶学分析显示:CMV的碱性磷酸酶活性是SMV的5.2倍,而SMV的Na+-K+ ATPase活性是CMV的5.7倍,有显着统计学差异。透射电镜扫描:CMV和SMV,为大小均一,直径约450nm的膜性囊泡。体外转运实验证实:分离得到的CMV具有转运活性。2.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子抗体的筛选以提取的大鼠肝细胞胆管侧膜小体为免疫原,免疫BALB/C小鼠,通过多次融合,利用比较ELISA法、获得了46株在大鼠肝细胞胆管侧细胞膜高表达分子的单克隆抗体。免疫组化组织定位结果显示:所得到的46株抗体在大鼠肝组织中的表达分布不尽相同。其中一株单克隆抗体特异性地定位于大鼠肝细胞胆管侧细胞膜上,命名为cm1,抗体亚类和亚型为IgG2a/κ型。Western blot定量分析,也证实其在肝细胞胆管侧细胞膜表达量明显高于血窦侧细胞膜的表达量,其所识别抗原的分子量约为140kDa。另外,有两株抗体在肝组织中表达呈特异性分布。一株抗体在大鼠肝小叶中央静脉周围肝实质细胞中的表达明显高于在肝小叶的汇管区周围肝实质细胞中的表达,命名为cv1;有趣的是cv1在人肝脏组织中表达在肝细胞的血窦侧细胞膜上以及肝血窦腔某种肝非实质细胞中,而在人和鼠肝组织中其所识别抗原的分子量均约为25kDa。另一株抗体特异性地表达在肝细胞核膜上,命名为nm1,其所识别抗原的分子量约为50kDa。有关这46株抗体的体外转运功能筛选还在进一步的进行中。3.大鼠肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的抗原鉴定我们首先对cm1、cv1和nm1这3株抗体所识别的抗原进行了进一步的鉴定。免疫沉淀、肽指纹图谱测序结果提示:cm1可能是一种新的表达在大鼠肝细胞胆管侧细胞膜上的特异性分子。双向电泳、Western blot结果显示,cv1识别抗原的等电点约为3-4;nm1抗体所识别的抗原为ATP合成亚单位β(ATPB)。结论:我们首次在国内利用密度梯度离心法成功分离出了大鼠肝细胞胆管侧细胞膜和血窦侧细胞膜,建立了具有功能的肝细胞胆管膜侧体外转运模型。该模型的建立,为进一步明确已知转运相关分子的生理功能及发现新的转运相关分子提供了有利的工具和手段,随着该模型的广泛应用,将为进一步明确肝脏复杂的生理功能及肝内胆汁淤积性肝病的发病机制奠定良好的基础。利用提取的大鼠肝细胞胆管侧膜小体为免疫原,通过比较ELISA法,筛选获得了46株在大鼠肝细胞胆管侧细胞膜高表达分子的单克隆抗体。其中,一株单抗特异性地结合在肝细胞胆管膜侧,我们将其命名为cm1,经免疫沉淀及肽指纹质谱测序,与已知转运分子进行比较分析,推测其可能为转运相关的新分子。第二株单抗,特异性地结合在大鼠肝小叶中央静脉周围肝实质细胞胞浆中,呈明显的区域分布差异,将其命名为cv1。有趣的是:cv1在人类表达在肝细胞的血窦侧细胞膜上,它们所识别抗原的分子量均约为25kDa,这种种属表达部位差异的分子还未见相关报道,推测其可能也为一个新分子。第叁株单抗特异性地识别肝细胞核膜,将其命名为nm1。抗原鉴定结果显示:nm1抗体所识别的抗原为ATP合成亚单位β(ATPB)。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
肝细胞胆管侧细胞膜论文参考文献
[1].蔡维乐.LAMP2参与调控MRP2在肝细胞胆管侧细胞膜定位的机制研究[D].第四军医大学.2017
[2].王敬博.肝细胞胆管侧细胞膜转运相关分子的筛选与鉴定[D].第四军医大学.2007