功能化类纸基的构建及其在细胞三维培养中的应用

论文摘要

细胞培养是体外研究细胞功能的重要技术手段。长期以来,基于培养皿的二维平面培养（2-dimensional culture,2D culture）在细胞生物学研究中得到了最为广泛的应用。然而,细胞在2D培养模式中的单层生长（monolayer）与细胞在体内环境中的生长方式的极大差异引起了研究者对体外细胞培养模式的思考。特别是在肿瘤药物的开发过程中,很多在体外细胞实验中展示良好抗肿瘤效果的药物,在体内实验中抗瘤效果却并不理想。三维细胞培养（3-dimensional culture,3D culture）是指在体外培养中通过使用特殊培养皿或支架材料,形成营养物质、代谢物和氧气的梯度,从而重现细胞体内环境,弥补单层培养缺陷的一种细胞培养模式。纸是人类最古老最重要的发明之一,而将纸基类材料作为一种新型的基底用于细胞培养则是古代智慧与现代科技的完美结合。首先,纸基中大量类似组织间隙的微小孔隙利于营养物质扩散,为细胞提供养分。其次,与基于聚二甲基硅氧烷（poly-dimethylsiloxane,PDMS）的细胞培养芯片相比,纸基的独特之处在于通过多层叠加可方便地实现3D结构组织/器官构建,而通过拆解多层纸基实现从3D至2D的结构转化,从而实现组织内部细胞形态和功能的观测分析。由于将纸类材料作为细胞培养的尝试刚刚开始,目前用于细胞培养的纸基材料主要是Whatman@#114号滤纸和Whatman@#105号擦镜纸,类型较为单一且同类比较下价格比较昂贵;有必要寻找适用于细胞培养的价廉物美的类纸基材料。此外,在实验中多需要将细胞先混合于水凝胶溶胶中再滴加到滤纸上。而且,在CiGiPs细胞培养模型中,纸质基底仅作为一种支架材料为水凝胶提供网络支撑,虽然解决了水凝胶塑形的问题,但仍缺乏相关的生物功能;同时,水凝胶现用现配的特性,降低了芯片制作使用的便捷性和普适性。基于对上述相关领域和关键技术现状与问题的分析,本论文首次探索了将中国传统书画用纸-宣纸用来探究细胞三维培养的潜力;将明胶溶液与聚丙烯无纺布采用冷冻干燥的方式制备即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料,用于细胞三维培养;进一步在即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料上有效负载细胞因子,构建具有生物活性的纸基,为细胞提供仿生三维生长环境和构建仿生微环境,为探究功能化类纸基为基材的仿生芯片奠定基础。本文主要研究内容如下:1、探索宣纸作为经济适用型细胞三维培养基材的潜力宣纸是我国所特有的书画用纸,具有柔韧、洁白、纹理清晰、润墨性好等特点,有“纸寿千年”的美誉。宣纸种类选择多,厚度可调控、价格相对低廉。本工作首先从市售种类的宣纸中选择了生宣、熟宣、半生半熟这三种宣纸作为研究对象。通过液体实验对宣纸的液体浸润性进行评估,结果显示生宣具备更加优异的液体浸润性,为细胞培养过程中细胞培养液的补给提供了条件。进一步将生宣与纸基材料（Whatman@#114号滤纸和Whatman@#105号擦镜纸）进行比较,研究发现宣纸的纤维素成分更加纯粹、纤维与纤维之间的小腔室有利于营养物质的运输和细胞之间的迁移。不同厚度的宣纸用于细胞培养。通过乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）释放实验发现宣纸对细胞的生长无毒性影响;通过WST-1细胞增殖测试发现细胞可以在宣纸上正常生长,而且在80μm厚的宣纸中细胞增殖最高,展示了良好的细胞相容性。宣纸纤维为细胞黏附与生长提供3D网络结构。通过细胞染色可以观察到,细胞在宣纸网络上大量黏附,而且随着培养时间的延长,细胞呈现增殖生长的趋势且依附宣纸纤维走向生长。最后通过构建基于宣纸的细胞免疫分析平台测定了前列腺癌中O-GaINAc的表达。与传统细胞微孔板相比,宣纸的纤维结构所提供的更大的比表面积促进了细胞的黏附和增殖,增强了细胞免疫分析中信号的表达,提高了细胞免疫检测的灵敏度,展示了宣纸应用到细胞分析平台的潜力。2、即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料的构建及其在3D细胞培养中的应用明胶（gelatin）是一种从动物体内提取出的胶原蛋白,具有良好的生物相容性,并被用于包被细胞培养皿以促进细胞黏附。聚丙烯（polypropylene）是应用最为广泛的聚合物之一,具有机械强度强、易于加工等特点。本工作中,我们首次提出了即用型CiGiPs的概念。我们将明胶溶液滴加到以聚丙烯为原材料的无纺布（polypropylene nonwoven fabric）基底上,采用冷冻干燥的方式制备即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料。在即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料中,明胶溶液的引入在聚丙烯无纺布的纤维与纤维之间形成蜂窝状的小腔室,增加了复合材料的比表面积。材料的孔隙率、溶胀性质和刚性测定实验表明,明胶@聚丙烯无纺布复合材料孔隙率显著增加,良好的溶胀性质有利于营养物质的储存。明胶@聚丙烯无纺布复合材料的生物相容性实验证明,明胶@聚丙烯无纺布复合材料可以应用于细胞培养,细胞大量黏附并呈现增殖生长的趋势。为了突出所提出的复合材料即用型这一概念,我们对最长放置了90天的复合材料进行了性质测试,结果显示明胶@聚丙烯无纺布复合材料化学性质和溶胀性质都未发生改变,更为重要的是细胞相容性保持良好,展现了作为细胞3D培养基材的应用潜力。3、细胞因子修饰的明胶@聚丙烯无纺布复合材料细胞因子是由免疫细胞和基质细胞合成的低分子量蛋白质,其通过与特定的受体结合来调控、参与人体的各种生理活动。在本工作中,将血管内皮生长因子（Human vascular endothelial growth factor,hrVEGF）负载于明胶@聚丙烯无纺布复合材料,构建具有生物活性的类纸基材料,为血管内皮细胞提供仿生三维生长环境。首先,探究如何在明胶@聚丙烯无纺布复合材料上有效负载细胞因子。通过吸附法、EDC/NHS共价结合方法和混合物冷冻干燥法制备负载生长因子的明胶@无纺布复合材料。研究结果显示具有生物活性的明胶@无纺布材料有利于细胞的快速黏附,并促进血管内皮细胞增殖。此外,将负载细胞因子的明胶@聚丙烯复合材料多层叠加构建细胞迁移模型。结果显示细胞可以从种植层迁移到负载细胞因子的迁移层,为构建功能化类纸基为基材的仿生芯片奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 体外细胞培养技术
•     1.1.1 细胞培养概述
•     1.1.2 3D细胞培养技术的分类
•   1.2 基于纸的细胞分析平台
•     1.2.1 基于纸的细胞分析平台概述
•     1.2.2 基于纸的细胞分析平台在细胞分析中的优缺点
•     1.2.3 基于纸的细胞分析平台的应用
•   1.3 气凝胶
•     1.3.1 气凝胶概述
•     1.3.2 气凝胶在细胞培养中的应用
•   1.4 研究目的、主要内容和创新点
•     1.4.1 研究目的
•     1.4.2 研究的主要内容
•     1.4.3 研究的创新点
• 第2章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验试剂
•     2.1.2 实验材料
•     2.1.3 实验用细胞种类
•   2.2 实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 细胞培养
•     2.3.2 细胞毒性测定
•     2.3.3 细胞增殖测定
•     2.3.4 细胞染色
•     2.3.5 纸基芯片的加工
• 第3章 探索宣纸作为经济适用型细胞三维培养基材的潜力
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 宣纸的表征
•     3.2.2 利用宣纸制备纸基细胞分析平台
•     3.2.3 宣纸生物相容性评估
•     3.2.4 以宣纸为细胞培养基底的的细胞免疫法测定前列腺癌中O-GaINAc
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 宣纸的表征
•     3.3.2 宣纸展现出良好的生物相容性
•     3.3.3 低成本宣纸免疫分析法可以测定前列腺癌中O-GaINAc的表达
•     3.3.4 本章小结
• 第4章 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料的构建及其在3D细胞培养中的应用
•   4.1 引言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料的制备
•     4.2.2 明胶@聚丙烯无纺布复合材料的表征
•     4.2.3 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料孔隙率、溶胀性质和材料刚性测定
•     4.2.4 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料生物相容性评估
•     4.2.5 基于即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料的细胞免疫测定
•     4.2.6 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料稳定性测试
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料应用于细胞培养
•     4.3.2 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料孔隙率、溶涨性质的增加有利于细胞的增殖和黏附
•     4.3.3 基于即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料的细胞免疫测定
•     4.3.4 即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料长期储存后,性质稳定
•     4.3.5 本章小结
• 第5章 细胞因子修饰的即用型明胶@聚丙烯无纺布复合材料
•   5.1 引言
•   5.2 实验部分
•     5.2.1 在明胶@聚丙烯无纺布复合材料上负载细胞因子VEGF
•     5.2.2 VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料的表征
•     5.2.3 VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料对细胞生长的影响
•     5.2.4 VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料对细胞黏附情况的影响
•     5.2.5 VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料多层叠加,探究细胞在不同层之间的迁移情况
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 共价结合的方式将细胞因子VEGF负载到明胶@聚丙烯无纺布复合材料上
•     5.3.2 VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料的表征
•     5.3.3 VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料有利于细胞的生长
•     5.3.4 VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料有利于细胞的黏附
•     5.3.5 细胞在VEGF-明胶@聚丙烯无纺布复合材料之间的迁移
•     5.3.6 本章小结
• 第6章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周莹

导师: 余玲

关键词: 细胞培养,三维生长,类纸基,即用型,细胞迁移芯片

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q813.11

总页数: 73

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