磷酸化肽段富集新材料和方法的发展及应用

论文摘要

磷酸化修饰是蛋白质翻译后修饰方式之一,几乎参与调节生命活动的整个过程,例如细胞增殖、发育与分化等。鉴于磷酸化修饰的重要性,进一步对其鉴定和分析显得十分必要。但是由于体内磷酸化修饰的动态性以及磷酸化蛋白化学计量相对较低,且磷酸基团容易在样品处理时降解,基于质谱的磷酸化修饰鉴定仍然面临众多挑战。因此,在质谱分析前对磷酸化蛋白或多肽进行富集和适当处理,对磷酸化修饰鉴定而言是至关重要的。可以说,有效的磷酸化多肽分离富集可以极大的提高磷酸化修饰鉴定效率。迄今为止,虽然众多方法已经被开发应用于质谱分析前的磷酸化肽段富集过程,包括基于抗体开发的富集策略、亲和色谱等策略,但是受限于本身固有的缺陷以及蛋白质整体的复杂性,这些方法的富集效果仍然不尽如人意。因此依然需要开发磷酸化肽段富集新策略。本研究通过溶胶-凝胶法,成功合成了新型纳米材料TiO2/Bi/Fe/Zr,并对其进行表征。TEM和SEM结果表明我们制备的TiO2/Bi/Fe/Zr纳米材料形态近似球状,且粒径约为50 nm。XPS、TEM mapping和EDS均检测出Ti、Zr、Bi和Fe元素存在,证明该材料被成功合成。XPS结果中Bi元素峰较高,暗示Bi主要存在TiO2表面;而Fe和Zr元素峰较低且二者与Ti离子的离子半径相近,表明Fe和Zr元素主要分布在TiO2内部。进一步N2吸附-解吸实验表明,由于Bi4+、Fe3+和Zr4+的掺杂,TiO2/Bi/Fe/Zr纳米材料（13.54 cm2/g）比表面积大于合成前体TiO2（5.07 cm2/g）,为磷酸化肽段提供更多的吸附位点。我们优化出新材料最优上样体系（1 mol/L羟基乙酸、5%TFA和80%ACN）和洗涤体系（1%TFA和30%ACN）。基于β-酪蛋白酶解物及其与BSA酶解后不同比例混合物,评估了该新型纳米材料对磷酸化肽选择性吸附能力。结果显示,当β-酪蛋白酶解物/BSA为1/100时,TiO2/Bi/Fe/Zr分别富集到6个磷酸化肽段,商业TiO2能富集到3个。比例进一步稀释到1:1000时,TiO2/Bi/Fe/Zr依然能富集到2个磷酸化肽段,而商业TiO2已富集不到磷酸化肽段。进一步以HeLa细胞裂解物作为富集对象探究该纳米材料富集能力及实用性,以HeLa细胞裂解物作为富集对象时,商业TiO2鉴定到了1076个肽段,对应1650个磷酸化位点,而新型TiO2/Bi/Fe/Zr纳米材富集到1276个肽段,对应1887个磷酸化位点。这些结果表明该纳米材料具有比商业TiO2更加优异的磷酸肽吸附能力,暗示该材料在磷酸化蛋白质组学研究中具有优异的应用潜力。为了评估纳米材料TiO2/Bi/Fe/Zr的实用性,该材料被运用于大鼠肝再生过程中血窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell,LSEC）质膜磷酸化蛋白质组学探究。本实验将SDS-PAGE与TiO2/Bi/Fe/Zr纳米材料富集磷酸化肽段相结合,从肝血窦内皮细胞质膜共鉴定到133个磷酸化肽段,对应98个磷酸化蛋白。其中假手术组鉴定到87个磷酸化肽段,匹配到69个磷酸化蛋白;肝切除72 h组鉴定到79个磷酸化肽段,匹配到68个磷酸化蛋白。在98个磷酸化蛋白中,有39个蛋白被两组共同鉴定到,其中差异倍数1.2倍以上磷酸化蛋白有24个。通过KEGG通路分析发现,LESCs质膜磷酸化蛋白主要涉及与血管生成相关的胰岛素和AMPK信号通路。总之,本章将TiO2/Bi/Fe/Zr材材运用于LSECs质膜磷酸化蛋白质组学研究,不仅扩展了该新型纳米材料的应用范围,也为研究肝再生过程中的血管生成机制提供线索。为进一步提高TiO2对磷酸化肽的选择性,通过溶胶-凝胶法合成了新型纳米材料TiO2/Si/Yb,并对其进行表征。TEM图和N2吸附-解吸实验结果表明,TiO2/Si/Yb材料呈现球形颗粒状,分散均匀,粒径约13 nm。由于Si4+离子的引入,不仅增加了TiO2的热稳定性,同时也阻止了晶粒的过度生长,使得TiO2的比表面积由10.8 m2/g增加到TiO2/Si/Yb的102.1 m2/g,为磷酸化肽段提供更多的吸附位点;同时稀土元素Yb3+的嵌合,也增强了TiO2/Si/Yb纳米材料对磷酸化肽段的静电吸附能力。XPS、mapping和EDS图谱均显示检测到元素Ti、Si和Yb的存在,表明TiO2/Si/Yb纳米材料被成功制备。首先以β-酪蛋白酶解物及其与BSA酶解后不同比例混合物评估新型纳米材料TiO2/Si/Yb富集磷酸化肽段的能力。结果显示无论是在富集磷酸化肽段数目还是背景噪音,TiO2/Si/Yb材料都是优于商业TiO2,且TiO2/Si/Yb纳米材料（4′10-1111 M）检测极限远低于商业TiO2（2′10-99 M）。然后用脱脂牛奶酶解产物和人血清评估TiO2/Si/Yb材料的实际应用潜力。结果表明:TiO2/Si/Yb纳米材料富集后共有10个来自于脱脂牛奶的磷酸化肽段被检测到,而商业TiO2鉴定到8个磷酸化肽段峰。人血清经TiO2/Si/Yb材料富集后,共有4个磷酸化肽被鉴定到,而商业TiO2鉴定到3个磷酸化肽段。无论是脱脂牛奶酶解产物,还是人血清样品,采用TiO2/Si/Yb纳米材料富集时,质谱图的背景干净且杂峰较少。这些结果表明新型纳米材料TiO2/Si/Yb比商业TiO2拥有更加优异的磷酸化肽段选择性吸附能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 蛋白质磷酸化修饰研究的意义
•   1.2 蛋白质磷酸化修饰研究现状及进展
•   1.3 磷酸化蛋白质/磷酸化肽段富集策略
•   1.4 磷酸化肽段/蛋白分离富集方法
•   1.5 磷酸化位点的质谱鉴定
•   1.6 选题目的和意义
• 2/Bi/Fe/Zr合成及其对磷酸化肽段富集能力的探究'>第二章 TiO₂/Bi/Fe/Zr合成及其对磷酸化肽段富集能力的探究
•   2.1 前言
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 实验材料和试剂
•     2.2.2 实验设备
• 2/Bi/Fe/Zr纳米材料合成'>    2.2.3 TiO₂/Bi/Fe/Zr纳米材料合成
•     2.2.4 材料表征数据测定
•     2.2.5 细胞复苏与传代培养
•     2.2.6 细胞全蛋白提取及蛋白质浓度测定
•     2.2.7 溶液内酶解
• 2/Bi/Fe/Zr富集磷酸化肽段'>    2.2.8 TiO₂/Bi/Fe/Zr富集磷酸化肽段
•     2.2.9 C18 tip脱盐
•     2.2.10 质谱分析
•     2.2.11 生物信息学分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 材料合成及表征
•     2.3.2 磷酸化肽段富集缓冲液浓度的优化
• 2/Bi/Fe/Zr对磷酸肽段富集回收率探究'>    2.3.3 TiO₂/Bi/Fe/Zr对磷酸肽段富集回收率探究
• 2/Bi/Fe/Zr对磷酸肽段富集能力及极限的探究'>    2.3.4 TiO₂/Bi/Fe/Zr对磷酸肽段富集能力及极限的探究
• 2/Bi/Fe/Zr从混合物中富集磷酸化肽段能力探究'>    2.3.5 TiO₂/Bi/Fe/Zr从混合物中富集磷酸化肽段能力探究
• 2/Bi/Fe/Zr对 HeLa裂解物中磷酸肽段富集能力探究'>    2.3.6 TiO₂/Bi/Fe/Zr对 HeLa裂解物中磷酸肽段富集能力探究
•   2.4 讨论
• 第三章 大鼠肝再生中血窦内皮细胞质膜磷酸化蛋白质组鉴定
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 材料与试剂
•     3.2.2 仪器与设备
•     3.2.3 70%大鼠肝切除模型的建立
•     3.2.4 大鼠肝再生阳离子硅胶灌注模型的建立
•     3.2.5 HE染色
•     3.2.6 大鼠肝脏血窦内皮细胞质膜蛋白提取
•     3.2.7 RC-DCTM结合BCA测蛋白浓度
•     3.2.8 SDS-PAGE电泳及蛋白免疫印迹
•     3.2.9 凝胶蛋白质点的酶解
•     3.2.10 质谱分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 大鼠肝再生模型构建及评估
•     3.3.2 肝血窦内皮细胞质膜蛋白分离纯化
•     3.3.3 SDS-PAGE分离磷酸化蛋白和免疫印迹分析
•     3.3.4 血窦内皮细胞质膜磷酸化蛋白质组分析
•     3.3.5 磷酸化位点及氨基酸分析
•     3.3.6 GO功能注释和KEGG信号通路分析
•     3.3.7 Sham和 PHx72 组血窦内皮质膜磷酸化蛋白比较分析
•   3.4 讨论
• 2/Si/Yb纳米材料制备及其富集磷酸化肽段探究'>第四章 TiO₂/Si/Yb纳米材料制备及其富集磷酸化肽段探究
•   4.1 前言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 材料与试剂
•     4.2.2 仪器及设备
• 2/Si/Yb纳米材料合成'>    4.2.3 TiO₂/Si/Yb纳米材料合成
•     4.2.4 材料的物理表征
•     4.2.5 样品制备及溶液内酶解
• 2/Si/Yb及TiO₂ 富集磷酸化肽段'>    4.2.6 TiO₂/Si/Yb及TiO₂富集磷酸化肽段
•     4.2.7 C18 tip脱盐
•     4.2.8 MALDI-TOF/TOF质谱分析
•   4.3 实验结果
• 2/Si/Yb纳米材料合成及表征'>    4.3.1 TiO₂/Si/Yb纳米材料合成及表征
• 2/Si/Yb富集磷酸肽段能力'>    4.3.2 基于标准磷酸蛋白评估TiO₂/Si/Yb富集磷酸肽段能力
• 2/Si/Yb富集磷酸肽段能力探究'>    4.3.3 基于混合物的TiO₂/Si/Yb富集磷酸肽段能力探究
• 2/Si/Yb富集磷酸化肽段稳定性探究'>    4.3.4 TiO₂/Si/Yb富集磷酸化肽段稳定性探究
• 2/Si/Yb富集能力'>    4.3.5 基于脱脂牛奶和人类血清探究TiO₂/Si/Yb富集能力
•   4.4 讨论
• 第五章 主要研究结果和进一步研究设想
• 参考文献
• 文章发表情况
• 缩写表（中英文对照）
• 附表
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 朱宝德

导师: 陈平

关键词: 纳米材料,磷酸化肽段,富集,质谱

来源: 湖南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 湖南师范大学

分类号: Q51

总页数: 164

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