来源于M.natoriense TNJL143-2的D-aminoacylase的活性中心研究

论文摘要

D-氨基酰化酶具有特异性催化水解N-酰基D-氨基酸酰基的能力。来自Microbacterium natoriense TNJL143-2（M.natoriense TNJL143-2）的D-氨基酰化酶（AcyM）与已知的几种D-氨基酰化酶具有24-27%的同源性。结构对比分析结果显示,几种已知的D-氨基酰化酶催化活性中心的氨基酸残基在AcyM中也存在。为确定AcyM的活性中心,探讨AcyM结构与功能的关系,在本研究中我们以M.natoriense TNJL143-2中编码AcyM的基因在大肠杆菌JM109中表达的酶（AcyM-pUC19）为研究对象。通过定点突变对AcyM-pUC19的氨基酸序列中的部分保守组氨酸残基以及第86位丙氨酸残基进行替换,并分别对各种突变酶的活性进行研究。表达鉴定结果显示各突变酶均为可溶性蛋白,活性鉴定结果显示突变酶H61A的活性为AcyM-pUC19活性的6%。突变酶H61D,H63A,H63D则完全失去活性。突变酶H201A,H201D的活性与AcyM-pUC19的活性大致相同。突变酶H232A,H232D的活性分别为AcyM-pUC19活性的51%和49%。突变酶A86C的活性与AcyM-pUC19的活性大致相同。这些结果表明所选突变位点中包含影响酶活性的关键氨基酸残基,在蛋白的空间结构中,这些关键氨基酸残基可能位于活性中心周围。通过各突变酶的活性变化可做出以下推测:在来源于M.natoriense TNJL143-2的D-氨基酰化酶中,其氨基酸序列中的第61为组氨酸残基对催化是必不可少的,但对底物结合不是必需的,而第63位组氨酸残基对底物结合起决定性作用。第201位组氨酸残基并不参与催化及底物识别,第232位组氨酸残基可能催化作用和底物结合。取代第86位丙氨酸残基的天冬氨酸残基并不能参与催化作用和底物结合。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 D-氨基酸
•     1.1.1 D-氨基酸的概念
•     1.1.2 D-氨基酸的生理功能
•     1.1.3 D-氨基酸用途
•     1.1.4 D-氨基酸的生产途径
•   1.2 D-氨基酰化酶
•     1.2.1 D-氨基酰化酶的研究现状
•     1.2.2 来源于M.natoriense的 D-氨基酰化酶（AcyM）
•   1.3 研究背景
•     1.3.1 重组表达载体的构建
•     1.3.2 突变位点的选择
•   1.4 本研究的技术路线
•   1.5 本研究的目的及意义
• 第2章 定点突变
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验仪器
•     2.1.2 实验菌株
•     2.1.3 试剂
•     2.1.4 培养基及溶液
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 JM109-pUC19-DAA菌种的恢复
•     2.2.2 薄层层析（TLC）法鉴定JM109-pUC19-DAA菌株
•     2.2.3 pUC19-DAA质粒的提取
•     2.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定pUC19-DAA质粒
•     2.2.5 pUC19-DAA质粒定点突变
•     2.2.6 PCR产物的鉴定
•     2.2.7 突变重组菌的转化
•     2.2.8 定点突变的鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 菌种的鉴定
•     2.3.2 定点突变的鉴定
•   2.4 本章小结
• 第3章 突变酶的表达与活性鉴定
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验仪器
•     3.1.2 菌株
•     3.1.3 试剂
•     3.1.4 培养基及溶液
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 菌种培养及粗酶液的获取
•     3.2.2 各突变酶的表达鉴定
•     3.2.3 标准曲线的制作
•     3.2.4 各突变酶的活性鉴定
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳鉴定各突变酶的表达
•     3.3.2 各突变酶活性鉴定
•   3.4 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 于笑晨

导师: 刘建

关键词: 氨基酰化酶,氨基酸,定点突变

来源: 长春理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 长春理工大学

分类号: Q517;Q78

总页数: 74

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