光对海洋放线菌代谢物合成的影响及关键菌株基因组挖掘

论文摘要

由于海洋环境的特殊性,海洋放线菌可能具有独特的代谢特征,其合成的次生代谢物是多种新天然产物和活性物质的重要来源,因此,利用海洋放线菌生产次生代谢物得到了国内外研究者的广泛关注。已知多种环境条件可影响放线菌合成次生代谢物,但是光照的作用到目前为止研究很有限。基于分子网络策略的质谱分析平台GNPS（Global Natural Product Social Molecular Networking）可用于在高效液相质谱检测大量样品后快速筛选到目标产物或排除重复发现的物质,并且有助于发现并鉴定已知化合物的新颖类似物。另一方面,利用基因组挖掘可加速新天然产物的发现,但目前对海洋放线菌基因组挖掘的研究还比较有限。基因组测序技术的快速发展使微生物天然产物的生物合成基因信息更易获得,并深入开发微生物的生物合成潜力,但是利用基因信息快速确定和分离鉴定预测的化合物仍然存在挑战。因此,结合GNPS平台和基因组挖掘技术可有助于加速研究和开发海洋放线菌天然产物的生物合成潜力。本文首先利用高效液相质谱技术结合GNPS分子网络分析平台,研究了光照和黑暗条件下63株海洋放线菌次生代谢物的合成情况。结果表明,光照对放线菌也长和代谢产物的合成具有不同程度的影响。一些菌株的菌落形态以及孢子产生量在光照和黑暗条件具有差异。不同放线菌光/暗条件下的代谢产物都有所不同,大多数海洋放线菌在光照条件下产生特殊化合物,只有少数海洋放线菌在黑暗条件下产生较多特定化合物。同时发现不同海洋放线菌受光照的影响程度不同,海洋放线菌如L036、S077和L014能在光照条件下产生超过40个特定化合物,而有的菌株如L064则没有特定化合物产生。此外,部分海洋放线菌如L159和S092在黑暗条件下比在光照条件下能产生更多的代谢物。对光照和黑暗条件下的化合物进行分析,大多数化合物为环状化合物,包括环肽类,如表面活性肽、piperazimycin和surugamide,以及大环内脂类（如巴佛洛霉素）等化合物,且相对较多的化合物会只在有光条件下检测到。这些光照条件下合成的化合物大多都具有抗菌生物活性,且都具有一定转运离子或者营养物质的功能。因此推测,光照条件下这些代谢物的产生可能有利于富集更多营养支持生长。此外,美达霉素、放线菌紫素和链玉红菌素都为色素类化合物,这些光吸收化合物能减少光胁迫,也可能将光能转化为海洋放线菌可以利用的化学能。以上研究发现个别菌株具有生产多种化合物的潜力,其中海洋链霉菌菌株DUT11、S063和星海链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T（菌株S187）的发酵液具有较好的抗补体活性,可用于开发药物治疗多种由于免疫系统过度激活引起的疾病。此外,海洋烷源戈登氏菌Gordonial alkanivorans S104具有良好的色素生产能力。因此,本文进一步利用基因组挖掘和GNPS平台对这些关键海洋放线菌菌株合成次生代谢物进行了研究。通过Streptomy,cessp.DUT11基因组挖掘和GNPS提供的质谱比对信息,鉴定了美达霉素（medermycin）、无活菌素（nonactin）及衣霉素（tunicamycin）类化合物,并发现前两者存在新的结构类似物。对菌株S063进行基因组测序,获得了完整的基因组,进一步敲除了 4个非核糖体多糖类抗生素的生物合成基因簇后获得的突变体抗补体活性没有变化,说明这4个基因簇与抗补体活性物质的合成无相关性。对海洋烷源戈登氏菌S104基因组进行分析,结合基因簇信息,验证了光对其色素合成的影响,基因组信息的挖掘也证明了该菌为具有海洋适应性的新颖海洋放线菌。最后,利用基因组挖掘对星海链霉菌S187的抗补体活性物质生物合成基因簇进行了研究,发现该菌株基因组存在一个糖肽类化合物基因簇nrps1,该基因簇与已知抗补体活性物质complestatin合成基因簇相似性很高,但多出两个基因sinPS和sinAS,同时推测核心肽上少一个甲基修饰。敲除前体合成基因sinPD,所获得的突变体抗补体活性消失,从而确定基因簇nrps1的产物与S187合成抗补体活性物质相关。本论文结合分子网络策略GNPS分析平台和基因组挖掘,对光照条件下海洋放线菌生成的次生代谢物进行了研究,发现了新的类似物,并确定了星海链霉菌合成抗补体活性物质的生物合成基因簇,所取得的结果为进一步开发利用海洋放线菌生产活性物质提供了借鉴。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 引言
• 1. 文献综述
•   1.1 质谱技术及GNPS分子网络
•     1.1.1 质谱技术
•     1.1.2 质谱技术的局限性
•     1.1.3 分子网络策略
•     1.1.4 GNPS分析平台
•     1.1.5 通过GNPS平台建立分子网络图的流程
•     1.1.6 GNPS平台的应用
•   1.2 环境条件对微生物生长及代谢产物的影响
•   1.3 海洋放线菌基因组挖掘
•     1.3.1 海洋放线菌及其基因组
•     1.3.2 基于全基因组序列研究放线菌分类学关系的新方法
•     1.3.3 基因组挖掘策略
•     1.3.4 利用基因组挖掘发现未知结构化合物
•     1.3.5 生物合成基因失活及比较代谢分析方法
•     1.3.6 通过调节调节基因和染色质重组来激活沉默未知基因
•     1.3.7 异源表达及比较代谢分析方法
•     1.3.8 培养条件优化及光诱导
•   1.4 放线菌及其生物活性研究
•     1.4.1 放线菌生物活性研究
•     1.4.2 放线菌天然产物研究
•   1.5 本论文研究意义
•   1.6 本论文研究目的、研究内容及技术路线
• 2. 光照对海洋放线菌天然产物合成的影响
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 本章使用的菌株
•     2.2.2 本章使用的培养基
•     2.2.3 菌种活化及种子液准备
•     2.2.4 光/暗条件培养
•     2.2.5 光/暗条件培养平板萃取样品准备
•     2.2.6 高相液相质谱分析条件
•   2.3 实验结果与讨论
•     2.3.1 光/暗条件下海洋放线菌生理生化的区别
•     2.3.2 光/暗培养的海洋放线菌代谢物质谱构建分子网络
•     2.3.3 光照对色素类化合物的影响
•     2.3.4 光照对环肽类化合物的影响
•     2.3.5 光照对其他环状化合物影响
•   2.4 本章小结
• 3. 海洋放线菌DUT11、S063及S104基因组挖掘
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 本章使用的微生物菌种
•     3.2.2 本章使用的培养基及溶液
•     3.2.3 本章使用的引物
•     3.2.4 菌种活化及种子液培养条件
•     3.2.5 基因组提取、测序及拼接
•     3.2.6 基因组分析方法
•     3.2.7 菌株发酵条件
•     3.2.8 海洋放线菌S063化合物分离纯化
•     3.2.9 目的基因的敲除
•     3.2.10 PCR反应体系及时间
•     3.2.11 抗补体活性测试方法
•     3.2.12 烷源戈登氏菌S104光/暗反应色素化合物发酵及分离
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 海洋链霉菌Streptomyces sp. DUT11基因组分析
•     3.3.2 海洋链霉菌Streptomyces sp. S063基因组及其活性研究
•     3.3.3 烷源戈登氏菌Gordonia alkanivorans S104基因组及代谢物
•   3.4 本章小结
• 4. 星海链霉菌基因组挖掘及抗补体活性物质合成基因簇确定
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 本章使用的菌株
•     4.2.2 本章使用的质粒
•     4.2.3 本章使用的培养基及溶液
•     4.2.4 本章使用的引物
•     4.2.5 基因组提取、测序、拼接及分析方法
•     4.2.6 菌种活化及种子液培养条件
•     4.2.7 星海链霉菌及转化子豆粉培养基大量发酵
•     4.2.8 基于λ-Red法敲除基因
•     4.2.9 验证接合转移
•   4.3 实验结果与分析
•     4.3.1 星海链霉菌基因组基本信息
•     4.3.2 星海链霉菌基因组比对
•     4.3.3 星海链霉菌次生代谢产物合成基因簇分析
•     4.3.4 星海链霉菌complestatin类似物合成基因簇
•     4.3.5 星海链霉菌抗补体活性研究及培养基发酵时间点实验
•     4.3.6 星海链霉菌nrps1合成基因簇表达验证及敲除转化子的制备
•     4.3.7 星海链霉菌nrps1基因簇的产物分离纯化尝试
•     4.3.8 星海链霉菌中夏霉素合成基因簇鉴定
•     4.3.9 星海链霉菌中铁载体合成基因簇
•     4.3.10 星海链霉菌中新霉素合成基因簇
•     4.3.11 星海链霉菌中其余NRPS及PKS化合物合成基因簇分析
•     4.3.12 星海链霉菌中羊毛硫抗生素合成基因簇分析
•     4.3.13 星海链霉菌中萜烯合成基因簇分析
•   4.4 本章小结
• 5. 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 创新点
•   5.3 展望
• 参考文献
• 附录A 关键化合物质谱图
• 附录B 本文研究相关的DNA序列
• 作者简介
• 攻读博士学位期间科研项目及科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 陈亮宇

导师: 赵心清

关键词: 海洋放线菌,光照,基因组挖掘,次生代谢物生物合成基因簇,全局天然产物交互分子网络

来源: 大连理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,有机化工

单位: 大连理工大学

分类号: Q933;TQ464

总页数: 176

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