以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病毒（4型、8b型）活疫苗的研制

论文摘要

禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）可分为I群、II群、III群,可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的疾病。其中I群禽腺病毒又可分为12个血清型,我国鸡群中主要流行血清4型（FAdV-4）和血清8b型（FAdV-8b）,分别引起心包积液综合征（Hydropericardium syndrome,HPS）和鸡包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）等疾病,给养禽业造成严重的经济损失。纤突蛋白（fiber）是禽腺病毒的重要结构蛋白,含有病毒的中和抗原表位,也与病毒的感染性有关。本研究以耐热新城疫病毒为载体,采用反向遗传技术分别构建表达FAdV-4和FAdV-8b纤突蛋白的重组病毒,并且评价了重组病毒活疫苗的免疫效力。1.以耐热新城疫病毒为载体的I群禽腺病（4型、8b型）重组病毒的构建以FAdV-4（GX2013株）和FAdV-8b（QD2016株）基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增fiber2基因和fiber基因,再将fiber2基因和fiber基因分别插入含有NDV/rAHR09弱毒株全基因组质粒rAHR09-P的P和M基因间隔区,构建rAHR09-P-FAdV-4 fiber2和rAHR09-P-FAdV-8b fiber。将两个重组质粒分别与表达NDVNP、P、L基因的质粒（pCI-NP、pCI-P、pCI-L）共转染BSR-T7/5细胞60 h,收毒后接种9-11日龄SPF鸡胚。经血凝试验证明拯救出重组病毒。通过RT-PCR及测序证明,fiber2基因和fiber基因分别插入了 NDV/rAHR09基因组中。将这两株重组病毒命名为rAHR09-4F2和rAHR09-8bF。Western Blot 试验显示,插入 NDV/rAHR09 中的 fiber2 基因和 fiber 基因均能够表达,两株重组病毒表达的蛋白条带大小与预期一致。耐热性试验结果显示:rAHR09-4F2和rAHR09-8bF经56℃处理70 min仍有HA活性,两株重组病毒与母本病毒均具有较好的耐热性。EID50试验测得rAHR09-4F2、rAHR09-8bF病毒滴度分别为107.42EID50/mL、107EID50/mL,两株重组病毒在鸡胚具有良好的复制能力。MDT 与 ICPI 试验结果显示:rAHR09-4F2 和 rAHR09-8bF MDT 大于 120 h,ICPI 数值均为0.050,两株重组病毒与亲本病毒毒力均无显著差异,仍为弱毒株。2.重组病毒免疫效力评价为了评价重组病毒rAHR09-4F2和rAHR09-8bF免疫效力,分别进行了免疫攻毒保护试验1和试验2。试验1分为rAHR09-4F2组、FAdV-4+FAdV-8b灭活疫苗组、攻毒对照组。7日龄SPF鸡,rAHR09-4F2组试验鸡通过滴鼻点眼接种rAHR09-4F2（106EID50）,灭活苗组经颈部皮下接种FAdV-4+FAdV-8b二价灭活疫苗（0.25 mL/只）。在免疫后第7、14、21、28d对各组试验鸡采血分离血清,通过血清中和试验（SNT）测定血清中FAdV-4和FAdV-8b中和抗体滴度。试验2分为rAHR09-8bF组、FAdV-4+FAdV-8b灭活疫苗组、攻毒对照组。处理方式与试验1一致。试验1的rAHR09-4F2组和灭活苗组试验鸡在接种后21 d中和抗体均达到峰值,产生的针对FAdV-4的抗体滴度分别为102.93和103.23。免疫后第21 d,各组试验鸡经肌肉注射攻FAdV-4（107.5TCID50/mL）,0.2mL/只。攻毒对照组在3d内全部死亡,rAHR09-4F2组在3 d内死亡5只,灭活苗组表现正常。分别于攻毒后3 d、7 d采集各组试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子,通过SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法测定病毒含量。在攻毒后第3d、7d,rAHR09-4F2组试验鸡呼吸道和消化道排毒量均高于灭活苗组,差异均显著（P≤0.05）。rAHR09-4F2刺激试验鸡产生的抗体水平较低,对FAdV-4具有50%的死亡保护效率,rAHR09-4F2能降低试验鸡的排毒量,但效果不显著。试验2的rAHR09-8bF组和灭活苗组试验鸡在免疫后7d开始产生中和抗体,在免疫后21 d达到峰值,产生的针对FAdV-8b的抗体滴度分别为103.11和103.15。免疫后第21 d,各组攻FAdV-8b（106.5 TCID50/mL）,0.2 mL/只。攻毒后,rAHR09-8bF组和灭活苗组表现正常,攻毒对照组出现拉稀现象。攻毒后第3d、7d,rAHR09-8bF组和灭活苗组呼吸道和消化道排毒量均低于攻毒对照组,且差异极显著（P≤0.01）。rAHR09-8bF组呼吸道和消化道排毒量与灭活苗相比,差异不显著（P>0.05）。rAHR09-8bF能刺激试验鸡产生较高水平的针对FAdV-8b的抗体,并能显著降低试验鸡的排毒量,保护效率可达90%左右。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 文献综述
•   1. Ⅰ群禽腺病毒的病原学特性
•     1.1 Ⅰ群禽腺病毒的血清分型
•     1.2 Ⅰ群禽腺病毒形态结构及理化特性
•   2. Ⅰ群禽腺病毒的主要蛋白质
•   3. Ⅰ群禽腺病毒流行现状
•   4. Ⅰ群禽腺病毒疫苗研究进展与防控
•     4.1 Ⅰ群禽腺病毒疫苗研究进展
•       4.1.1 全病毒灭活疫苗
•       4.1.2 弱毒活疫苗
•       4.1.3 基因工程疫苗: 亚单位疫苗与DNA疫苗
•     4.2 Ⅰ群禽腺病毒防控
•   5. 新城疫病毒作为疫苗载体的发展
•   6. 耐热新城疫病毒研究进展
•   研究目的及意义
• 第一章 以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病（4型、8b型）重组病毒的构建及生物学特性测定
•   1. 材料与方法
•     1.1 材料
•       1.1.1 质粒、菌株及病毒
•       1.1.2 细胞及鸡胚
•       1.1.3 主要实验试剂
•       1.1.4 主要仪器设备
•     1.2 方法
•       1.2.1 引物设计与合成
•       1.2.2 病毒DNA的提取及目的基因的扩增
•       1.2.3 rAHR09-P质粒的酶切
•       1.2.4 FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber基因的克隆与测序
•     1.2.4.1 序列测定与分析
•       1.2.5 病毒的拯救与鉴定
•     1.2.5.1 细胞与辅助质粒的准备
•     1.2.5.2 共转染
•     1.2.5.3 重组病毒的鉴定
•       1.2.6 重组病毒耐热性测定
•       1.2.7 重组病毒生物学特性测定
• 50测定'>    1.2.7.1 重组病毒EID₅₀测定
•     1.2.7.2 重组病毒MDT测定
•     1.2.7.3 重组病毒ICPI测定
•   2 结果
•     2.1 FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber基因的扩增
•     2.2 rAHR09-P质粒的酶切
•     2.3 重组质粒鉴定
•     2.4 病毒的拯救与鉴定
•     2.5 重组病毒的耐热性测定
•     2.6 重组病毒的生物学特性测定
• 50测定'>      2.6.1 重组病毒EID₅₀测定
•       2.6.2 重组病毒MDT和ICPI测定
•   3 小结与讨论
• 第二章 以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病毒（4型、8b型）重组病毒免疫效力评价
•   1 材料与方法
•     1.1 材料
•       1.1.1 病毒及细胞
•       1.1.2 实验动物
•       1.1.3 主要实验试剂
•       1.1.4 主要仪器设备
•     1.2 方法
•       1.2.1 血清4型+8b型禽腺病毒二价油乳剂灭活苗的制备
•       1.2.2 重组病毒的免疫攻毒试验
•     1.2.2.1 重组病毒的免疫试验
•     1.2.2.2 免疫后抗体水平监测
•     1.2.2.3 攻毒试验
•     1.2.2.4 攻毒后排毒量检测
•   2 结果
•     2.1 试验1
•       2.1.1 免疫后抗体水平监测
•       2.1.2 攻毒试验
•       2.1.3 排毒量检测
•     2.2 试验2
•       2.2.1 免疫后抗体水平监测
•       2.2.2 攻毒试验
•       2.2.3 排毒量检测
•   3 小结与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李保珍

导师: 吴艳涛,张小荣

关键词: 耐热载体,重组病毒,生物学特性分析,免疫保护效力

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家蛋鸡产业技术体系项目(CARS-40-K16),扬州大学“高端技术人才支持计划”(2016年度)江苏高校优势学科建设工程资助项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001893

总页数: 53

文件大小: 4090K

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