柑橘U-box基因家族的鉴定和CRISPR/Cas9编辑CcPUB4基因的研究

论文摘要

盐胁迫是世界范围内危害植物的主要逆境胁迫之一,严重抑制植物的生长和产量。柑橘是世界上以及我国南方重要的果树种类之一,属于对盐极敏感的甜土植物,在中国柑橘主产区经常出现盐害现象,在盐胁迫下植株表现出失绿、叶尖焦枯、枯枝落叶、品质变劣,甚至死树等症状（魏清江等,2015;Maas.,1993）。随着工业污染加重和化肥使用不当等人为因素的出现,盐碱土面积在不断增加,给柑橘生产带来了重大的威胁。所以挖掘出与盐胁迫相关基因,了解柑橘对盐胁迫的响应及适应性机制,培育出抗逆性品种对生产具有重要意义。U-box蛋白广泛存在于植物基因组中,其结构高度保守,在泛素降解途径中发挥E3泛素连接酶的作用（Smalle et al.,2004）,在非生物胁迫响应过程中具有重要作用（Vierstra.,2009）。已有研究表明植物U-box蛋白（Plant U-box protein,PUB）通过调控盐胁迫响应基因的表达,提高植物体排Na+和保K+能力,维持体内的Na+/K+平衡,最终提高植物的耐盐性（李巧茹,2017）。因此,本研究对柑橘U-box基因家族进行生物信息学分析,包括基因结构、进化分析和诱导表达分析等,筛选到可能与盐胁迫相关的候选基因CcPUB4,同时为研究CcPUB4与抗逆性的关系,本研究针对CcPUB4基因构建了CRISPR/Cas9载体进行转基因功能验证,主要研究如下:（1）从柑橘克里曼丁（Citrus clementina）全基因组中鉴定出56个CcPUBs基因家族成员,可将其分为7类,即U-box only、U-box+ARM1、U-box+WD401、TPR+U-box、Kinase+U-box、U-box+ARM2和U-box+WD402,并在1-9号Scaffold上分布不均;该家族蛋白理论等电点和分子量等理化性质差异较大;启动子分析表明CcPUBs基因家族不仅响应光和干旱等外界环境还能应答激素的影响。（2）本研究通过对枳壳（Poncirus trifoliate Raf.）在冷胁迫下的RNA-Seq数据分析发现U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答,并表现出4种不同的应答模式（先下降再上升、先上升再下降、一直上升、一直下降）;从柑橘U-box基因家族的5个不同簇上分别选取1个代表基因进行qRT-PCR,分析结果表明,U-box基因家族表达具有组织特异性并且能响应激素和非生物胁迫;CcPUB4受Na+诱导表达并且其高表达在柑橘响应盐胁迫过程中有着重要作用。（3）CRISPR/Cas9技术已广泛应用于众多物种中,并取得了较高的编辑效率,为进一步确定CcPUB4与抗逆性的关系,针对CcPUB4通过在线与体外检测的方式设计合适的敲除靶点,构建了pP1C.1C-gRNA-1、pP1C.1C-gRNA-6和pP1C.1C-gRNA-1+gRNA-6三个载体,利用农杆菌介导法转化锦橙,获得了CcPUB4突变植株,主要发生碱基缺失;在线设计和体外酶切的方式设计gRNA能提高CRISPR/Cas9的编辑效率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
•   1.1 土地盐渍化
•   1.2 盐胁迫对植物的伤害
•     1.2.1 水分亏缺
•     1.2.2 离子毒害
•     1.2.3 营养失衡
•   1.3 盐胁迫对植物生理的影响
•     1.3.1 盐胁迫对植物生长的影响
•     1.3.2 盐胁迫对植物光合作用的影响
•     1.3.3 盐胁迫对活性氧和抗氧化酶的影响
•   1.4 柑橘对盐胁迫的适应机制
•     1.4.1 形态学的适应
•     1.4.2 渗透调节物质合成
•     1.4.3 ROS清除
•   1.5 泛素/26S蛋白酶体途径（Ubiquitin-Proteasome pathway,UPP）
•   1.6 U-box蛋白
•     1.6.1 U-box蛋白的结构特点
•     1.6.2 U-box蛋白的分类
•     1.6.3 U-box蛋白的功能
•   1.7 CRISPR/Cas9 系统
•     1.7.1 CRISPR/Cas9 系统的发展
•     1.7.2 CRISPR/Cas系统的结构及分类
•     1.7.3 CRISPR/Cas9 系统的应用
• 第2章 前言
•   2.1 立题依据
•   2.2 创新性
•   2.3 技术路线
• 第3章 柑橘U-box基因家族的鉴定及表达分析
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 柑橘U-box基因家族成员鉴定
•     3.2.2 柑橘U-box家族系统进化及蛋白结构域分析
•     3.2.3 柑橘U-box家族基因结构及Scaffold定位分析
•     3.2.4 柑橘U-box基因家族的启动子分析
•     3.2.5 胁迫处理
•     3.2.6 总RNA提取
•     3.2.7 cDNA合成
•     3.2.8 实时荧光定量PCR与数据分析
•     3.2.9 柑橘U-box家族基因的冷胁迫表达模式分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 柑橘U-box基因家族成员信息
•     3.3.2 柑橘U-box家族系统进化及蛋白结构域分析
•     3.3.3 柑橘U-box家族基因结构及染色体定位分析
•     3.3.4 柑橘U-box基因家族的启动子分析
•     3.3.5 U-box家族基因的表达分析
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第4章 柑橘盐胁迫基因CcPUB4的CRISPR/Cas9 载体构建
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 植物材料
•     4.1.2 载体及菌株
•     4.1.3 主要仪器
•     4.1.4 主要试剂
•     4.1.5 主要溶液的配制
•     4.1.6 CcPUB4 基因的生物信息学分析
•     4.1.7 枳壳和朱红桔差异分析
•     4.1.8 CcPUB4 基因g RNA靶位点设计
•   4.2 CcPUB4 基因CRISPR/Cas9 载体构建
•     4.2.1 BbsⅠ单酶切pP1C.
•     4.2.2 pP1C.5 载体酶切产物回收
•     4.2.3 引物退火形成双链
•     4.2.4 双链g RNA连接到pP1C.5 载体
•     4.2.5 连接产物转化至大肠杆菌
•     4.2.6 单克隆菌液PCR检测
•     4.2.7 pP1C.5 重组质粒提取
•     4.2.8 pP1C.5 重组载体与pP1C.1C载体的双酶切
•     4.2.9 纯化回收酶切后的片段
•     4.2.10 目的片段与pP1C.1C载体连接与转化
•     4.2.11 单克隆菌液PCR检测
•     4.2.12 gRNA-1和g RNA-6 同时连接到pP1C.1C
•     4.2.13 pP1C.1C重组载体转化农杆菌EHA105 感受态细胞
•     4.2.14 柑橘的遗传转化
•     4.2.15 转基因植株的鉴定
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 CcPUB4 基因的生物信息学分析
•     4.3.2 枳壳和朱红桔差异分析
•       4.3.2.1 NaCl诱导枳壳朱红桔中CcPUB4 基因表达分析
•       4.3.2.2 枳壳和朱红桔 CcPUB4 基因的 CDS 序列差异
•     4.3.3 CcPUB4 基因的gRNA设计
•     4.3.4 CRISPR/Cas9 载体的构建
•     4.3.5 T0代CcPUB4 基因敲植株表型和突变鉴定
•   4.4 讨论
•   4.5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表论文及参加课题

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李秋月

导师: 江东

关键词: 盐胁迫

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 西南大学

分类号: Q943.2;S666

总页数: 85

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