乳糖诱导E.coli发酵生产FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶

论文摘要

黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基的葡萄糖脱氢酶（FAD-GDH,EC1.1.5.9）,具有辅基结合紧密、催化效率高的优点,可替代目前诊断用葡萄糖氧化酶应用于血糖指标的临床生化检测。本文选取Burkholderia cepacia的葡萄糖脱氢酶基因（gdh）构建表达质粒pTrc99a-gdh,转化E. coli BL21（DE3）。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导发酵,通过酶活测定及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,获得可溶性表达的FAD-GDH,分子量约为60000。利用乳糖替代IPTG作为诱导剂,摇瓶水平初步探索诱导条件,酶活达到994U/L。7.5L发酵罐放大培养该菌,采用梯度流加补料策略,分阶段温度控制,并采用不同的乳糖流加速率进行诱导。当采用0.3mL/min的乳糖流加速率时,酶活达22200U/L,菌体量达69.48g/L。经过镍柱层析,最终获得纯酶的比酶活104.5U/mg。为医用诊断原料用酶葡萄糖脱氢酶新酶种的工业化生产提供借鉴。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株及质粒
•     1.1.2 主要试剂
•     1.1.3 培养基及缓冲液
•   1.2 方法
•     1.2.1 重组大肠杆菌的构建
•     1.2.2 重组大肠杆菌培养方法
•     1.2.3 菌体生物量测定
•     1.2.4 葡萄糖脱氢酶酶活测定及SDS-PAGE分析
•     1.2.5 葡萄糖脱氢酶的纯化
• 2 结果与讨论
•   2.1 重组大肠杆菌的构建
•   2.2 重组FAD-GDH的表达及鉴定
•   2.3 乳糖作为诱导剂产FAD-GDH摇瓶条件优化
•     2.3.1 乳糖浓度的影响
•     2.3.2 乳糖诱导时机的影响
•     2.3.3 诱导温度的影响
•     2.3.4 乳糖诱导时间的影响
•   2.4 不同乳糖流加速率对7.5L发酵罐产酶的影响
•   2.5 葡萄糖脱氢酶的镍柱亲和纯化
• 3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张玲,宋祖坤,林荣,王男,杨海麟

关键词: 黄素腺嘌呤二核苷酸,葡萄糖脱氢酶,乳糖诱导,发酵优化,层析分离

来源: 化工进展 2019年04期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑

专业: 一般化学工业

单位: 江南大学工业生物技术教育部重点实验室

基金: 江苏省产学研项目(BY2016022-40),国家轻工技术与工程一流学科自主课题(2018-23)

分类号: TQ925

DOI: 10.16085/j.issn.1000-6613.2018-1256

页码: 1879-1886

总页数: 8

文件大小: 2453K

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