一、STUDIES ON THE DETECTION KIT FOR THE COLORECTAL CARCINOMA ASSOCIATED LARGE EXTERNAL ANTIGEN（论文文献综述）
袁梦云,张星星,谢晓东,陈敏,王红星,吴坚,赵智强[1]（2020）在《基于巨噬细胞极化观察白术内酯Ⅱ对胃癌细胞的作用》文中研究指明目的:研究白术内酯Ⅱ对巨噬细胞极化的影响并探讨其发挥抗肿瘤的作用机制。方法:用佛波酯（PMA）诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞,噻唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度白术内酯Ⅱ作用不同时间,对巨噬细胞生长的影响,筛选出白术内酯Ⅱ的安全给药浓度。不同浓度白术内酯Ⅱ作用24 h,巨噬细胞与胃癌细胞共培养,光镜下观察2种细胞的存活状态,MTT比色法检测胃癌细胞的增殖变化,筛选出白术内酯Ⅱ的有效给药浓度。将细胞分为空白组、模型组、白术内酯Ⅱ(200,100,50 mg·L-1)组。划痕实验观察不同浓度白术内酯Ⅱ作用后巨噬细胞对胃癌细胞迁移及形态的影响。流式细胞术（FCM）检测M1,M2型巨噬细胞表面标志CD86,CD206表达;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测M1,M2型巨噬细胞相关肿瘤坏死因子（TNF）-α,人类白细胞抗原2（HLA-DRA）,CD80,转化生长因子-β（TGF-β）,白细胞介素（IL）-10和IL-6 mRNA和蛋白表达;Western blot检测巨噬细胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）和磷酸化（p）-PI3K蛋白表达。结果:当白术内酯Ⅱ质量浓度为1,10,50,100,200 mg·L-1时,对巨噬细胞生长无抑制作用;与模型组比较,50,100,200 mg·L-1白术内酯Ⅱ作用的巨噬细胞可显着抑制胃癌细胞增殖（P<0.01）;与模型组比较,白术内酯Ⅱ(200,100 mg·L-1)组胃癌细胞迁移率降低（P<0.05）;白术内酯Ⅱ(200,100,50 mg·L-1)组M1型巨噬细胞表面标志CD86表达增高（P<0.05,P<0.01）,白术内酯Ⅱ(200 mg·L-1)组M2型巨噬细胞表面标志CD206表达下降（P<0.05）;白术内酯Ⅱ(200,100 mg·L-1)组M1型巨噬细胞相关细胞因子TNF-α,HLA-DRA,CD80 mRNA表达增高（P<0.05,P<0.01）,白术内酯Ⅱ(200 mg·L-1)组TNF-α蛋白表达增高（P<0.05）;白术内酯Ⅱ(50 mg·L-1)组M2型巨噬细胞相关细胞因子TGF-βmRNA表达显着降低（P<0.01）,白术内酯Ⅱ(200 mg·L-1)组IL-10,IL-6蛋白表达降低（P<0.05,P<0.01）;白术内酯Ⅱ(200,100 mg·L-1)组p-PI3K蛋白表达降低（P<0.05,P<0.01）。结论:白术内酯Ⅱ通过减少巨噬细胞内p-PI3K的表达,诱导巨噬细胞向M1型极化,进而抑制胃癌增殖和迁移。
刘浩聪[2]（2020）在《KRAS蛋白p.G12S位点突变的单链抗体筛选及鉴定》文中研究指明研究背景KRAS基因是RAS家族中最易激活的癌基因之一,17%-25%的肿瘤具有激活的KRAS基因突变。致癌的KRAS基因激活突变的关键区域主要为第12、13、59、61和63密码子。这些突变被激活的方式是通过失活内源性GTP酶活性并引起GTP酶活性蛋白抵抗,从而使GTP结合态的RAS蛋白含量增高。在我国肿瘤患者中,KRAS基因突变位点主要为第2号外显子12号和13号密码子。其中以p.G12D和p.G13D位点点突变为主,也可见p.G12S点突变等。KRAS基因突变在不同类型的肿瘤中也不尽相同,诸如结直肠腺癌和非小细胞肺癌的患者中,在一定程度上其不同的基因位点突变与患者的预后相关。利用基因工程等方式筛选针对某位点突变的特异性单链抗体能够为制定个性化靶向治疗策略提供理论依据。随着肿瘤的生物治疗不断发展,有效的特异性靶向治疗的抗体药物,在提高药物有效率的同时能够大大降低药物产生的毒副作用。目前,新型的靶向药物如西妥昔单抗和一些免疫检查点抑制剂等已经应用于多种肿瘤的靶向及免疫治疗并取得了良好的结果。但是对于存在RAS基因特定位点突变的肿瘤,多种靶向药物则难以达到预期的治疗效果。因此寻找特异性的针对特定位点突变的抗体,对肿瘤的生物治疗具有极其重要的意义。目前肿瘤免疫相关理论均认为在肿瘤患者体内必然存在着肿瘤特异性抗原,能够诱发机体产生针对肿瘤的免疫反应,理论上机体能够产生针对特异性抗原的特异性抗体。但是,寻找肿瘤特异性抗原和相应的抗体是十分困难的事情。单链抗体是利用基因工程的方法将传统抗体的轻链可变区和重链可变区通过一段核苷酸链拼接而成的重组蛋白,它具有分子量小,免疫原性低,穿透力强,定位迅速,且易于基因工程制备和改造等优点,非常适合用于肿瘤靶向治疗。而20世纪90年代出现的噬菌体展示技术则为噬菌体抗体库的建立奠定了理论基础。同时使肿瘤相关单链抗体的发现和制备成为可能。想获得高亲和力的特异性抗体,主要取决于两个重要的决定因素:抗体库的库容和制备来源,理想的抗体筛选应该出自尽可能大的库容并直接来源于人体,但因为条件所限,多数相关研究较难同时具备这两点。目的:本研究拟通过基因工程和噬菌体展示技术构建人源性噬菌体单链抗体库,以期从中筛选出具有高亲和力和特异性的针对KRAS p.G12S位点突变的单链抗体,为肿瘤的诊断及基因靶向治疗提供新的方案。方法:收集10例健康的志愿者外周血,并签署知情同意书,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,反转录为cDNA,通过PCR等方法扩增出多样性的单链抗体重链和轻链可变区片段并构建单链抗体基因库,将噬菌体质粒双酶切,与双酶切后的单链抗体基因库相连接,再将连接产物电转化入大肠杆菌TG1,构建初级单链抗体库;2.以基因重组表达的含有p.G12S的蛋白为靶抗原,通过多轮洗涤,筛选出具有高亲和力的特异性抗该位点突变的单链抗体,并对其结构序列进行分析;3.通过ELISA等方法,鉴定获得的单链抗体的亲和力和特异性,以及蛋白的基本表达情况。结果:利用基因工程和分子克隆的相关技术,成功构建了库容量约为1×1013的初级噬菌体单链抗体库,且所获得抗体具有良好的多样性;2.以重组表达的含有p.G12S的蛋白为靶抗原,利用噬菌体展示的方法,通过2轮淘洗,成功构建具有高亲和力的抗p.G12S位点突变的单链抗体库,通过酶切、核酸测序等方法比对,判定所得单链抗体基因的轻重链序列是否与人IgG抗体轻重链可变区序列具有高度同源性（>90%）。结论:构建出1013库容的人源性初级单链抗体库筛选出具有高亲和力和特异性的针对KRAS蛋白p.G12S位点突变的单链抗体
杨思雨[3]（2020）在《TNF-α对Tc9细胞分化和抗肿瘤作用的研究》文中指出恶性肿瘤是目前威胁人类生命健康的主要疾病之一,其治疗方法主要有手术治疗、化学治疗、放射线治疗,近年来肿瘤的免疫治疗作为肿瘤生物治疗的技术之一,因其副作用小等优点成为科研人员的研究热点。肿瘤的免疫治疗是靶向机体自身免疫系统的一种治疗方法,通过提高自身免疫系统的抗肿瘤能力达到肿瘤治疗的目的。细胞过继免疫治疗是肿瘤免疫治疗的方法之一,是将致敏淋巴细胞输给细胞免疫功能低下者（如肿瘤患者）,使其获得抗肿瘤免疫力。细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）是传统的肿瘤杀伤效应T细胞,可以直接杀伤肿瘤细胞,也是目前应用于肿瘤过继免疫治疗的主要效应T细胞。细胞毒性T细胞9（Tc9细胞）是近年来新发现的细胞毒T细胞亚群,相比于目前应用于临床的Tc1细胞而言,具有体内存活时间长,能够发挥长效抗肿瘤作用的优点;此外,有研究表明,虽然Tc9细胞在体外对肿瘤的直接杀伤作用较弱,但Tc9细胞可以在体内分化为Tc1样细胞,使其抗肿瘤作用增强。因此Tc9细胞有望成为更有效的细胞过继免疫治疗的效应T细胞。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是TNF家族成员之一,是一种具有多种生物学功能的细胞因子,不但可以诱导细胞炎性因子的产生,还参与了细胞的增殖、存活以及凋亡等生物学反应。前期研究发现TNF-α可以影响辅助性T细胞（Th细胞）的生成和增殖。由于相同亚型的Th细胞和Tc细胞的极化环境具有相似性,且Tc9细胞在过继免疫治疗中具有巨大潜力。因此,本研究将深入探讨TNF-α对Tc9细胞的影响,以期更有效的诱导和扩增肿瘤特异性Tc9细胞并提高其相关分子（如IL-9）的表达水平,从而更好的发挥其肿瘤免疫疗效。研究主要分为以下三部分:第一部分TNF-α对Tc9细胞的体外诱导作用目的:探究TNF-α对Tc9细胞体外分化,存活以及增殖能力的影响,明确TNF-α对Tc9细胞的诱导作用。方法:（1）分选后的CD8+T细胞在Tc0、Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α,体外培养2天后,qPCR及流式检测IL-9的mRNA及蛋白质表达情况;（2）将分选后的CD8+T细胞在与（1）相同的培养环境下,体外培养2天后,qPCR检测Tc细胞相关的细胞因子、效应分子以及分化分子的表达情况;（3）将分选后的CD8+T细胞在与（1）相同的的培养环境下,体外培养2天后,流式检测T细胞凋亡以及Ki67分子表达情况。结果:（1）在体外诱导Tc9细胞的过程中加入TNF-α,提高了IL-9的mRNA及蛋白质表达水平;（2）加入TNF-α后,其他Tc细胞相关的细胞因子及效应分子没有明显改变;与对照组相比,TNF-α诱导的Tc9细胞的CD44分子表达增加;（3）与常规诱导的Tc9细胞相比,TNF-α诱导的Tc9细胞的Ki67的表达量增加且Annexin V阳性Tc9细胞数降低。结论:TNF-α可以在体外环境下促进Tc9细胞的分化,提高Tc9细胞的存活能力以及增殖能力,即TNF-α对Tc9细胞具有明显的诱导作用。第二部分TNF-α对Tc9细胞的体内抗肿瘤效应的影响目的:探究TNF-α对Tc9细胞的体内抗肿瘤效应的影响。方法:（1）体外培养OT-I小鼠来源的Tc9细胞和TNF-α诱导的Tc9细胞,过继免疫治疗B16-OVA荷瘤C57BL/6小鼠,对比肿瘤的生长情况;（2）体外培养OT-I小鼠来源的Tc9细胞和TNF-α诱导的Tc9细胞,用于过继免疫治疗B16-OVA肿瘤肺转移小鼠,检测肿瘤组织中IL-9的mRNA表达情况,对比T细胞的肿瘤部位浸润情况;（3）通过体内杀伤实验,对比常规Tc9细胞和TNF-α诱导的Tc9细胞的体内特异性杀伤能力。结果:（1）相比于常规诱导的Tc9细胞,TNF-α诱导的Tc9细胞能够更有效地减缓肿瘤生长;（2）相比于常规Tc9细胞治疗组,TNF-α诱导的Tc9细胞治疗组检测到更高水平的IL-9的表达,即肿瘤部位浸润了更多的TNFα-Tc9细胞;（3）与Tc9细胞组相比,TNF-α诱导的Tc9细胞组能够更有效地特异性杀伤靶细胞。结论:TNF-α可以提高Tc9细胞的肿瘤部位浸润能力和特异性杀伤能力,增强Tc9细胞的抗肿瘤效应。第三部分TNF-α诱导Tc9细胞的作用机制研究目的:探究TNF-α诱导Tc9细胞的作用机制。方法:（1）初始CD8+T细胞在Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α以及TNF受体封闭抗体,体外培养2天后,qPCR及流式检测IL-9的mRNA及蛋白质表达情况;（2）将分选后的CD8+T细胞在与（1）相同的培养环境下,体外培养2天后,流式检测T细胞存活以及增殖情况;（3）初始CD8+T细胞在Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α,检测STAT5、NF-κB通路相关蛋白;初始CD8+T细胞在Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α以及STAT5、NF-κB阻断剂,体外培养2天后,qPCR及流式检测IL-9的mRNA及蛋白质表达情况。结果:（1）TNF-α诱导的Tc9细胞在加入TNFR2封闭抗体后,IL-9的表达水平比加入TNFR1封闭抗体或未加入封闭抗体的实验组低;（2）加入TNFR2封闭抗体后,TNF-α诱导的Tc9细胞的凋亡水平增加,增殖能力下降;（3）TNF-α诱导的Tc9细胞的p-STAT5和p-IKKα/β分子表达量增加;应用STAT5、NF-κB封闭抗体后,TNF-α促进Tc9细胞的生成和IL-9的表达被抑制。结论:TNF-α通过结合TNFR2促进Tc9细胞分化、存活以及增殖;STAT5、NF-κB信号通路参与了TNF-α促进Tc9细胞分化的过程。
李琦玮[4]（2020）在《益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨》文中研究表明研究背景:乳腺癌居于全球女性癌症死亡原因的首位。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型,其分子表型呈雌激素受体（ER）阴性、孕激素受体（PR）阴性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）阴性,约占全部乳腺癌的10-20%。TNBC由于缺乏有效的治疗靶点,往往预后不佳。乙酰肝素酶（HPSE）是哺乳动物体内唯一一种用于切割硫酸乙酰肝素（HS）侧链的β-D-葡萄糖内切糖苷酶,通过切割HS侧链过程重塑细胞外基质（ECM）结构,释放具有生物活性的小分子物质,如生长因子、细胞因子等,协助肿瘤的侵袭与转移,促进肿瘤血管生成,有助于肿瘤的发展。HPSE在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的恶性进展呈正相关。有研究发现,乙酰肝素酶具有调控细胞基础自噬过程的作用。自噬是一种进化保守的细胞通过溶酶体进行物质降解代谢的过程,一般认为,自噬在肿瘤的发生、发展过程中具有双刃剑的效果。在肿瘤产生之前,自噬可以清除损伤的细胞器或异常合成的蛋白质,减轻炎症反应,避免DNA损伤,预防肿瘤的发生;当体内出现肿瘤细胞时,自噬可以激活免疫细胞的抗原呈递功能,激活T细胞,增强免疫应答功能清除肿瘤细胞。然而肿瘤发生之后,肿瘤细胞可利用自噬作为其必要的生存机制,通过自噬过程为肿瘤细胞的生存和发展提供营养物质和能量支持,以此应对外周环境压力,获得增殖或转移的机会。由于TNBC目前仍然缺乏有效的治疗靶点,且易对治疗产生抵抗,寻找有效的辅助治疗手段提高TNBC的疗效十分重要。研究者对于包括传统中医药在内的补充替代治疗日益关注。千百年来,中药被广泛用于包括癌症在内的各种疾病的治疗。中药结合常规现代治疗有助于提高肿瘤疗效,减轻治疗毒副作用,改善肿瘤患者的生存质量。郁仁存教授、王笑民教授根据多年临证经验总结“益气活血解毒法”,并据此治则创立相关方剂,在临床上治疗各类恶性肿瘤取得了良好的疗效。基于益气活血解毒法,我们选择四种中药单体联合应用并评价其疗效。这些单体包括黄芪甲苷（提取自黄芪,代表“益气”）,龙葵碱（提取自植物龙葵,代表“解毒”）,莲心碱（提取自莲子,代表“解毒”）,川芎嗪（提取自川芎,代表“活血化瘀”）。我们将这四种单体组合简称“SANT”,并对其在肿瘤体内外模型中进行研究。研究目的:评价益气活血解毒中药单体组合SANT对MDA-MB-231 Hpa/Mock肿瘤的影响并分析相关机制。研究方法:在本研究中,我们首先利用数据库进行肝素酶表达与乳腺癌患者生存的相关性分析。利用MTS、trans-well和划痕实验评价SANT对肿瘤细胞增殖、迁移的影响。共聚焦实验用于观察SANT处理后231-Hpa细胞中GFP-RFP-LC3蛋白的变化。免疫印迹实验用于检测相关蛋白标志物表达。动物实验用于评价SANT在体内的疗效与安全性。最后我们采用人类自噬相关PCR微阵列和血管生成蛋白微阵列用于相关机制探索。研究结果:1.HPSE在多种癌症类型中高表达,乳腺癌中HPSE mRNA表达水平超过正常乳腺组织2倍以上。HPSE高表达的乳腺癌患者无复发生存期（P=1.7e-12）与总生存期（P=0.00016）都显着短于HPSE低表达的乳腺癌患者。TNBC患者的HPSE转录效率高于非三阴性乳腺癌患者。2.肿瘤细胞231-Hpa具有显着上调的肝素酶水平,231-Hpa细胞内LC3B-I/-Ⅱ转化率也显着高于231-Mock细胞（P=0.0003）。在乳腺癌原位移植瘤模型中,免疫荧光显示231-Hpa移植瘤HPSE表达显着升高;231-Hpa组肿瘤负荷（0.608g 与 0.437g,每组≥6 只,P=0.0242）,肺重（0.167g 与 0.148g,每组≥6只,P=0.0164）均显着高于对照组。231-Hpa组Ki-67染色与CD31染色均显着高于 231-Mock 组。3.体外实验:经过24小时处理,龙葵碱在0-64μM浓度范围将231-Mock细胞生存率降低近50%,231-Hpa细胞生存率降低约60%;经过48小时处理,龙葵碱对于231-Mock细胞抑制率为68.93%,对231-Hpa细胞抑制率为81.06%。甲基莲心碱（NEF）处理细胞24-48h后也达到60-80%的抑制率。黄芪甲苷和川芎嗪对肿瘤细胞增殖影响不明显。在Trans-well实验中,与对照组相比,SANT对231-Hpa细胞迁移的抑制率达79%,对231-Mock细胞迁移抑制率达72%。划痕实验也取得类似的结果,经过24小时SANT处理,231-Hpa细胞的划痕愈合面积下降了 51.5%,231-Mock细胞的划痕愈合面积下降了 40.6%。SANT在免疫印迹实验中可轻度降低活性形式HPSE的表达,对惰性形式HPSE的影响不明显。SANT和PI-88（肝素酶抑制剂）在体外均可轻微降低肝素酶活性带的表达。在荧光共聚焦观察实验中,转入GFP-RFP-LC3B标记的231-Hpa细胞经过SANT药物处理12h后,可以观察到大量LC3蛋白与溶酶体融合形成的黄色斑点,表示自噬过程的发生。Western实验可见,SANT处理细胞不同时间后引起了 LC3B-Ⅱ表达的升高,SANT与自噬抑制剂CQ联用可使LC3B-Ⅱ表达进一步升高,表明自噬流量的发生。4.体内实验中,SANT与PI-88均可以显着抑制肿瘤的生长（SANT与对照组,360.59 与 598.32mm3,P=0.0381;PI-88 与对照组,3 64.93 与 598.32mm3,P=0.0344）。SANT、PI-88组肿瘤重量较对照组也明显下降（SANT与对照组,0.29与 0.54g,P=0.0046;PI-88 与对照组,0.37 与 0.54g,P=0.0262）。肿瘤组织的免疫组化染色中,与对照组相比,SANT显着降低了 Ki-67表达（17.76±3.41%与7.52±2.02%,P<0.0001）,效果优于PI-88组。SANT明显抑制了微血管（MVD）（57%,P<0.0001）与血管生成拟态（VM）（33%,P=0.0019）的形成,但 PI-88抑制血管生成的效果更佳。安全性评价中,SANT在体内对小鼠的生化指标无明显影响。5.机制探索:对肿瘤组织进行人类自噬相关基因PCR微阵列检验结果显示,SANT处理显着上调了部分自噬过程相关基因,包括ATG10,ATG16L1,ATG16L2,ATG4B,ATG4D,ATG9A等,而PI-88处理组显着下调了一些自噬相关基因如AMBRA1,ATG16L1,ATG4D,BAD,BCL2L1等。肿瘤血管生成相关蛋白微阵列研究结果显示,SANT治疗组中HB-EGF,thrombospondin-2,amphiregulin,leptin,IGFBP-9,EGF,coagulation factor Ⅲ,MMP-9（前体及活性形式）表达上升,serpin E1,platelet factor 4表达下降。结论:肝素酶（HPSE）高表达常见于侵袭性乳腺癌患者中,与不良预后相关。HPSE促进肿瘤增殖,引起小鼠体内肺转移增多,在体外提高了肿瘤细胞自噬水平。体外研究中,SANT抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并增强肿瘤细胞的自噬水平。体内实验中,SANT在小鼠体内抑制肿瘤生长与血管生成过程。SANT对自噬相关基因或血管生成相关蛋白表达具有调控作用,可能与其肿瘤抑制作用相关。SANT是一种具有前景的用于三阴性乳腺癌辅助治疗的药物,这种药物组合研究拓展了天然化合物的应用思路。
胡孜鸣[5]（2020）在《靶向肺癌LunX的CAR-T细胞治疗》文中提出肺癌是目前全球高发的癌症之一,它具有高死亡率以及预后差等特点,然而目前针对于肺癌,并没有非常有效的治疗手段。近些年,随着细胞治疗的发展,CAR-T细胞治疗的研究和临床实验也在如火如荼的进行中。CAR-T细胞治疗是将T细胞从病人外周血中分离出来,经过体外的活化后利用慢病毒,逆转录病毒或者电转染等方式对T细胞进行转染,使其能够过表达CAR序列,而后通过一系列的检测和质控,再回输入病人的体内达到靶向杀伤肿瘤的目的。在过去的一些报道和临床实验中,虽然CAR-T细胞对于血液肿瘤有着良好的杀伤效果,但是对于实体肿瘤的治疗一直效果欠佳,主要原因包括:1、肿瘤微环境是一个免疫抑制的环境,存在大量免疫抑制细胞和细胞因子;2、缺乏特异性有效的靶点。前期研究证实肺癌细胞特异性高表达LunX蛋白,且用LunX单克隆抗体S-35-8治疗肺癌小鼠模型取得了很好的疗效,那么制备针对LunX蛋白的CAR-T细胞可能对肺癌也有着很好的治疗效果。基于此,我们展开了对针对LunX抗原的CAR-T细胞研究,并取得了如下结果:1、LunX特异性CAR-T细胞的构建我们使用SPR检测了 LunX蛋白单克隆抗体S-35-8与LunX抗原蛋白的亲和力,结果显示两者有着很高的亲和力,这也为我们后续的实验提供了充分条件。接着我们设计了 CARLunX的分子序列,在5’LTR段用信号肽序列来引导跨膜,随后使用S-35-8的单链抗体识别区序列和CD8α铰链区,用来增加CAR分子的灵活性,为了检测整个分子的的跨膜结构,我们在胞外区加入了 c-Myc标签蛋白,在CD28分子的跨膜区后连接着4-1BB共刺激域,同时我们使用另一个启动子EF1α来启动GFP荧光蛋白的表达,用来指征转染效率。我们分别将构建好的质粒直接进行PCR检测以及转染入293T细胞中进行RT-PCR检测,结果显示构建的CAR分子可以成功表达。接下来,为了进一步探究我们构建的CAR分子是否可以跨膜,我们将转染了 CAR分子的293T细胞进行免疫荧光的检测,我们从结果中可以看到,当293T细胞转染了 CAR序列以后,其细胞膜会大量表达C-Myc标签蛋白分子,胞内有GFP荧光蛋白的表达。以上结果说明,我们成功构建了CARLunX质粒。2、LunX抗原可以刺激CARLunX T细胞分泌细胞因子构建好CAR质粒以后,我们包装了慢病毒,并对T细胞进行了感染,通过对GFP以及c-Myc标签蛋白的检测,结果提示T细胞已高效率过表达CAR序列。随后对过表达CAR序列的T细胞进行免疫荧光检测,我们进一步确认CAR序列在T细胞中成功跨膜表达。为了探究CARlunXT细胞与LunX抗原是否有直接的作用,我们分别在铺有LunX的培养板里加入空白对照T细胞,无关对照CARCD19T和CARlunXT细胞进行孵育,经过24小时后,我们发现只有加入CARlunXT细胞的培养上清中有高浓度的效应细胞因子IFN-γ,IL-2和TNF-α。这些表明CARlunXT细胞可以被LunX抗原直接活化,并分泌大量的效应细胞因子。3、CARlunXT细胞可以靶向杀伤LunX抗原阳性的肺癌细胞我们分别用免疫荧光以及流式细胞术检测了肺癌细胞系NCI-H292,NCI-H1650,A549以及正常肺纤维细胞系HFL1表面LunX分子的表达情况,结果表明肺癌细胞系均表达LunX分子。我们使用CARlunXT细胞以及CARCD19T细胞对靶细胞进行杀伤检测,结果显示只有CARlunXT细胞才对LunX蛋白阳性的肺癌细胞系有特异性杀伤作用,而CARCD19T细胞不对肺癌细胞进行特异性的杀伤。4、LunX阳性的肺癌细胞可以特异性的活化CARlunXT细胞我们将肺癌细胞系NCI-H292,NCI-H1650以及A549分别与CARlunXT细胞和CARCD19T细胞共孵育后检测培养体系上清中效应细胞因子的浓度以及效应细胞的增殖情况,我们发现在靶细胞的刺激下,CARlunXT细胞会特异性分泌大量IFN-γ,IL-2和TNF-α,同时也会特异性的活化增殖。5、CARlunXT细胞可以抑制小鼠移植原位瘤模型的生长在之前的结果,我们已经验证了 CARlunXT细胞在体外对靶细胞有特异性杀伤作用,那么CARlunXT细胞在体内是否可以行使杀伤效应呢?于是我们构建了小鼠的移植原位瘤模型,发现经过CARlunXT细胞治疗后,小鼠相比于对照组,肿瘤的大小以及生长速率都得到了很好的抑制,与此同时,CARlunXT细胞治疗组小鼠的生存率也得到了明显的改善,为了观察CARlunXT细胞细胞在肿瘤中的浸润情况,我们对小鼠的肺脏进行了免疫荧光的检测,我们可以看到在肿瘤中有大量CARlunXT细胞的浸润。由此,CARlunXT细胞可以在体内发挥特异性的杀伤功能。6、CARlunXT细胞可以抑制小鼠PDX皮下肿瘤模型的生长为了进一步接近于病人体内肿瘤的真实情况,我们选用了病人来源的肺癌组织,对小鼠进行了皮下移植,经过测量和观察,使用CARlunXT细胞治疗以后,小鼠的PDX肿瘤的大小得到了明显的移植,同时生存率也得到了提升。为了观察CARlunXT细胞在肿瘤中的浸润情况,我们对肿瘤进行了免疫荧光检测,结果显示肿瘤内部存在CARlunXT细胞的浸润。在治疗期间,我们对小鼠的体重进行了统计,与对照组相比,小鼠的体重保持在比较稳定的状态,说明CARlunXT细胞治疗在体重方面不存在副作用。所以,CARlunXT细胞可以有效治疗PDX小鼠模型。综上所述,我们构建了针对于肺癌的CARlunXT细胞,并在体外和体内对其特异性和有效性进行了验证,发现CARlunXT细胞可以对肺癌细胞在体外进行有效的杀伤,同时在小鼠模型中,CARlunXT细胞可以抑制肿瘤的生长,延长小鼠的生存率。该研究中CARlunXT细胞对于治疗肺癌实体瘤具有潜在价值。
吴怡晨[6]（2019）在《经血间充质干细胞对肝癌细胞表观调控机制研究》文中研究表明间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）具有靶向炎症部位及肿瘤的特性,因此被认为是潜在的肿瘤治疗载体。然而由于MSC与肿瘤细胞之间的相互作用机制至今仍未阐明,限制了其临床应用可行性。因此探讨MSC与肿瘤之间的作用机制尤为重要。肿瘤微环境与肿瘤的发生,发展及耐药密切相关。MSC作为微环境中的重要背景细胞,主要通过旁分泌多种成分,改变肿瘤微环境,进而影响肿瘤细胞的生物学功能。肿瘤细胞的表观动态变化与所处微环境的改变密切相关。因此,表观遗传学改变是肿瘤细胞应对微环境改变的重要遗传学标志,能够灵敏地反应肿瘤细胞与肿瘤微环境之间交互作用。经血间充质干细胞（Menstrual blood-derived mesenchymal stem cell,MenSC）作为一种新型MSC,通过旁分泌多种成分抑制肿瘤细胞的生长。然而,MenSC对肿瘤微环境的影响以及对肿瘤细胞的表观调控机制至今仍未被探讨。本研究首先通过体外,体内实验探究MenSC对肝癌细胞生长的作用。体外实验主要通过transwell共培养体系进行CCK8实验,平板克隆实验,流式凋亡实验、细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR等,验证了MenSC在体外对肝癌细胞的生长具有抑制作用。同时MenSC对肝癌细胞生长的影响伴随着5羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5-hmC）和甲基化催化酶的表达改变。体内实验主要通过建立裸鼠移植瘤模型,经尾静脉移植MenSC后,肝癌细胞生长被显着抑制。同时,免疫组化实验进一步证实了,MenSC在体内对肝癌细胞的增殖具有抑制作用并伴随着表观催化酶的表达改变。为了进一步阐明MenSC对肝癌细胞的表观调控作用机制,我们联合DNA羟甲基化测序、甲基化测序和RNA测序技术,从基因组层面探讨MenSC对肝癌细胞的DNA羟甲基化和甲基化修饰的调控。结果表明MenSC能影响肝癌细胞的全基因组羟甲基化和甲基化修饰水平。同时,MenSC主要通过调控增强子和启动子区域的5-hmC和5-mC水平抑制相关致癌通路,包括PI3K/AKT和MAPK通路。AKT和MAPK通路的抑制进一步解除了对FOX03的抑制,激活其下游细胞凋亡通路。同时,MAPK通路的失活阻断了下游c-myc介导的EMT通路。此外,MenSC通过改变基因调控区域的表观修饰下调化疗耐药相关的基因ID4、HMGA1等,而与肝癌预后风险相关的基因HMGA1、BYSL等在MenSC治疗后显着下调,有望成为MSC靶向治疗的潜在靶基因。因此,我们得出以下结论:1、MenSCs在体内和体外均对肝癌细胞有抑制生长作用;2、MenSCs在体内和体外对肝癌细胞具有表观调控作用;3、MenSCs主要通过调控增强子和启动子区域的5-hmC和5-mC水平抑制P13K/AKT和MAPK信号通路,进而影响下游生物学功能。本研究有助于阐明MSC对肿瘤微环境及与肿瘤细胞间的作用机制,为未来基因修饰M S C靶向治疗以及与表观药物联合治疗提供重要的理论依据。
张娜[7]（2020）在《母乳婴儿源益生菌筛选及其干预炎症性肠病的免疫效应和相关机制研究》文中研究说明生命早期是肠道微生物群正确建立的关键时期,肠道菌群的早期定植又直接影响着婴儿免疫系统的发育和成熟,进而对机体健康产生短期,中期甚至是长期的影响。在这一生命阶段,母婴垂直传播在新生儿肠道微生物初始定植中发挥关键作用,而在众多传播途径中:羊水、阴道、空腔、皮肤、母乳等,尤以母乳喂养最为主要。乳酸菌,作为人体肠道菌群中一类重要的益生菌,与宿主的健康密切相关:某些特定的菌株已被证明具有免疫调节、缓解氧化应激、抑制炎症性肠病等功能,并且有报道认为:机体和肠道微生物之间具有特异性的相互选择关系:当菌株的来源和其应用到对象保持一致时,就会显着增强菌株对机体益生功能的特异性和有效性,即:最理想的益生菌最好是来源于人体本身。本研究采集纯母乳喂养婴儿新鲜粪便,从中分离出一系列乳酸菌株,并以抗人工消化液能力、耐胆盐能力、黏附能力等为指标,筛选出一株具有潜在益生功能的乳酸菌,通过对其16S rRNA进行测序并结合生理生化试验结果初步确定为植物乳杆菌,命名BF15,同时通过体外试验对该菌株的安全性（抗生素敏感性、有害代谢产物、溶血性等）及益生功能（免疫调节、抗氧化能力）进行了初步评估;进一步分析了该菌株在小鼠肠道中的定植能力及体内免疫调节功能;最后以DSS诱导小鼠UC为模型,从调节免疫、缓解氧化应激、平衡肠道菌群等方面对其缓解UC的功能进行较为全面的评价,并通过蛋白质组学揭示其干预炎症性肠病的作用机制。研究内容如下:1.采用Hungate厌氧培养技术对纯母乳喂养婴儿粪便中的乳酸菌进行分离,并以鼠李糖乳杆菌GG为阳性对照菌株,以耐酸、耐胆盐、耐受模拟人体消化液、黏附能力等生物特性为指标筛选具有潜在益生特性的菌株,通过生理生化试验结合16S rRNA测序鉴定菌株,进一步通过体外试验对所筛选菌株的安全性（有害代谢产物、药敏性、溶血性）及益生功能（体外免疫调节和抗氧化能力）进行初步评价。结果表明:经过各项指标的测定,筛选出一株益生性能表现良好（人工胃肠液高耐受性、体外高黏附性）的菌株,经生理生化试验和16S rRNA测序鉴定确定该菌株为植物乳杆菌,命名为BF15;体外安全性试验表明BF15除具有对氨基糖苷类、糖肽类抗生素的固有耐药性外,对苯唑西林、头孢噻吩也具有耐药性,但该菌株中不存在抗性质粒,并且不产生生物胺、亚硝酸盐和哚类有害代谢产物,且不具有溶血性,因而具备一定的安全性;体外益生功能评价结果表明一方面BF15的活性/热致死菌在一定的菌浓范围内（1×106～107CFU/mL）均能在体外促进小鼠淋巴细胞增殖,并且在相同菌浓条件下,与LGG体外免疫调节能力没有显着性差异（P>0.05）,另一方面BF15能够耐受高浓度的H2O2（3.5 mmol/L）,而且有较强的自由基（O2-·、·OH和DPPH）清除和抗脂质过氧化能力。2.应用基于rpo B基因的PCR-DGGE分子技术分析菌株在小鼠肠道内的定植情况;同时以环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制为模型,以LGG为阳性对照菌株,通过测定脏器指数、脾淋巴细胞转化值、血清溶血素水平、足趾肿胀度和巨噬细胞吞噬指数等各项免疫指标,分析肠道菌群多样性,对BF15保护小鼠免受环磷酰胺诱发的免疫抑制及肠道菌群紊乱能力进行评估。结果表明:BF15在停止灌胃后的第14 d仍可在小鼠粪便中检测到,具有较强的定植能力;同时BF15的早期灌胃可以明显抵制CTX诱发的小鼠免疫相关指标（脏器指数、脾淋巴细胞转化值、血清溶血素水平、足趾肿胀度及巨噬细胞吞噬指数等各项免疫）降低（P<0.01）及肠道菌群失调（Bacteroides相对丰度降低,Firmicutes及包含大量潜在致病菌的Proteobacteria的相对丰度升高;参与菌群各代谢通路的功能基因丰富度的失调:参与碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、聚糖生物合成和代谢等多各代谢通路的相对丰度显着减弱,参与细胞运动相关的代谢通路的相对丰度显着增强）,具备一定的免疫调节能力。3.以葡聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎为模型,以LGG为阳性对照菌株,从调节免疫功能、缓解氧化应激、平衡肠道菌群等多角度评估BF15对溃疡性结肠炎的缓解作用,进一步通过结肠组织的蛋白质组学,从蛋白质水平揭示BF15干预溃疡性结肠炎的作用机理。结果表明:通过早期灌胃,菌株BF15通过减轻肠道黏膜损伤及炎症细胞浸润,缓解肠道黏膜氧化应激损伤（提高GSH-Px和SOD的活性,降低MDA的含量）,提高能量代谢水平（提高超微量ATP酶活性）,调节肠道黏膜免疫功能（抑制促炎因子（IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF-α）,促进抑炎因子（IL-10及sIgA）的表达）能够有效缓解小鼠结肠炎症症状;同时BF15还缓解了由葡聚糖硫酸钠诱发的肠道菌群结构紊乱（Bacteroides和Actinobacteria相对丰度降低,Firmicutes、Proteobacteria、Verrucomicrobia 和 Tenericute 相对丰度提高,F/B（Firmicutes/Bacteroides）比值增大的紊乱趋势以及参与菌群各代谢通路的功能基因丰富度的失调:参与嘌呤、核糖体、氨基糖和核苷酸糖代谢、染色体等多个代谢通路的功能基因相对丰度减弱,而参与转运载体、ABC转运载体、双组分系统等相关代谢通路功能基因的相对丰度增强）;最后通过对不同组别差异表达蛋白的生物信息学分析,揭示了益生菌（BF15/LGG）主要通过回调溃疡性结肠炎模型组中的差异蛋白（BF15主要回调 GSH-Px、pIgR、AR、ALOX15、MMP-2、ApoC-Ⅲ 等差异蛋白,LGG 主要回调 pIgR、ALOX15、ApoC-Ⅲ、TN、MMP-2等差异蛋白）,使其趋向于正常的表达水平,进而调节抗原加工和抗原提呈系统对小鼠UC进行干预的作用机理。本论文研究成果将为丰富我国开发具有原创性的人源益生菌添砖加瓦,同时也为婴幼儿功能性食品提供优良的菌种资源。
陈渊[8]（2018）在《第三代LMP1 CAR-T细胞的制备及对鼻咽癌细胞杀伤作用研究》文中进行了进一步梳理鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是耳鼻咽喉头颈外科最常见的恶性肿瘤,常因病灶复发和头颈部淋巴结转移而影响患者生存质量。目前放疗为鼻咽癌治疗的首选,但是由于鼻咽癌早期症状并不典型,患者往往错过治疗的最佳阶段,彻底清除鼻咽癌细胞存在较大困难。以T细胞过继治疗为基础发展而来的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）T细胞治疗技术因其特有的靶向性,特异性杀伤肿瘤细胞成为肿瘤免疫治疗的“新贵”。目前,以CD19为标靶的代表性CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤（特别是B细胞前体急性淋巴细胞白血病）取得明显的疗效,并被美国FDA批准上市。虽有CD19 CAR-T细胞顺利治愈复发性脑胶质瘤的个案,然而大部分实体瘤缺少特异性靶标和体内免疫逃逸机制,始终是CAR-T细胞应用于实体瘤必须攻克的两大难点。研究表明,鼻咽癌可由EB病毒感染所致。EB病毒介导鼻咽上皮细胞非极化,通过对EMT通路的调控诱导鼻咽部上皮细胞的转化,干扰正常鼻粘膜细胞的生理功能,促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭,并且抑制其凋亡。EB病毒潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1,LMP1）在鼻咽癌细胞的广泛表达,而在正常组织中基本不表达,使其成为最佳的诊断和治疗的靶点。本研究在利用抗体库技术制备全人源LMP1抗体的基础上,通过构建第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,制备第三代LMP1 CAR-T细胞,证实其在体内外对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用,为鼻咽癌免疫治疗临床研究提供坚实的基础。研究目的1.制备针对LMP1基因的第三代CAR-T细胞2.优化LMP1 CAR-T细胞的增殖、分化与表达效率3.探讨LMP1 CAR-T细胞在体内外对鼻咽癌细胞的杀伤作用研究方法1.以实验室早期制备保存的高亲和力的全人源LMP1 Fab为模板,设计引物合成LMP1 sc Fv的重轻链,利用overlap PCR构建LMP1的sc Fv段,利用基因工程技术将LMP1 sc Fv段与含有CD8α,CD28,CD137,CD3ζ的慢病毒载体重组,制备第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,PCR法与测序用于验证所构建的LMP1 CAR慢病毒表达载体的正确性。2.LMP1 CAR慢病毒表达载体由转染试剂PEI转染到X-293T细胞,以CD3ζ抗体为一抗,Western blot法检测LMP1 CAR在X-293T细胞中的表达。3.应用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离健康志愿者外周血,提取PBMC,经CD3、CD28抗体激活,IL-2刺激扩增,获得足够量的T细胞。LMP1 CAR病毒包装产物感染T细胞制备LMP1 CAR-T细胞。4.培养鼻咽癌细胞（CNE1、CNE2、HONE1、C666-1与SUNE1）,流式细胞术与Western blot法检测鼻咽癌细胞表面LMP1的表达,分别筛选LMP1高表达,低表达以及不表达的鼻咽癌细胞株。5.收集鼻咽癌细胞与制备的LMP1 CAR-T细胞,共培养6h后,CCK8法检测效靶比20:1、10:1、5:1、2:1时,LMP1 CAR-T细胞对鼻咽癌细胞（CNE1、CNE2、HONE1）的杀伤作用。T细胞与CD19 CAR-T细胞设立为对照。6.CCK8法检测LMP1 CAR-T细胞在效靶比10:1时对鼻咽癌细胞的杀伤作用。LMP1高表达淋巴瘤细胞株Raji设立为对照。7.收集鼻咽癌细胞与制备的LMP1 CAR-T细胞,共培养24h后,收集上清,ELISA法检测LMP1 CAR-T细胞在鼻咽癌细胞刺激下,细胞因子（IL-2、IFN-γ）的分泌情况。T细胞与CD19 CAR-T细胞设立为对照。8.筛选Luciferase标记的LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1的稳定株。裸鼠单侧腋下注射CNE1细胞成瘤后,第0,3,6天瘤周注射CAR-T细胞,每次注射前进行活体成像,检测LMP1 CAR-T细胞在体内对LMP1阳性鼻咽癌移植瘤的增殖抑制作用。CD19 CAR-T细胞,T细胞与生理盐水作为对照。9.裸鼠双侧腋下注射鼻咽癌细胞,一侧为100%LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1,另一侧为50%LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1+50%LMP1阴性鼻咽癌细胞HONE1,成瘤后0,3,6天瘤周注射CAR-T细胞,分别于第0天与第9天进行活体成像,比较检测LMP1 CAR-T细胞对LMP1阳性与LMP1阴性鼻咽癌移植瘤的杀伤效应。研究结果1.成功制备第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,PCR结果显示条带大小与理论值一致,基因测序结果显示制备的LMP1 CAR序列正确。2.Western blot检测CD3ζ的表达,条带大小与理论值一致,结果显示LMP1CAR慢病毒表达载体能在X-293T细胞中表达。3.成功筛选出LMP1高表达鼻咽癌细胞株CNE1,LMP1低表达鼻咽癌细胞株CNE2与LMP1不表达鼻咽癌细胞株HONE1。4.CCK8结果显示LMP1 CAR-T细胞在效靶比20:1与10:1时对LMP1阳性的鼻咽癌细胞的杀伤作用与CD19 CAR-T细胞与T细胞相比具有统计学差异（P<0.05）。效靶比为10:1时,LMP1 CAR-T细胞对鼻咽癌细胞CNE1、CNE2的杀伤率分别为（66.51±4.06）%和（49.91±6.81）%,与CD19 CAR-T细胞和T细胞相比具有统计学差异（P<0.05）。而LMP1 CAR-T细胞对鼻咽癌细胞HONE1的杀伤率为（33.33±0.91）%,与CD19 CAR-T细胞和T细胞相比无统计学差异（P>0.05）。5.ELISA结果表明,LMP1 CAR-T细胞与鼻咽癌细胞CNE1共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为（1,962.58±54.65）pg/ml和（2,229.73±45.69）pg/ml;LMP1 CAR-T细胞与鼻咽癌细胞CNE2共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为（550.86±98.64）pg/ml和（438.21±44.52）pg/ml,与CD19CAR-T细胞和T细胞相比具有统计学差异（P<0.05）。而LMP1 CAR-T细胞与鼻咽癌细胞HONE1共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为（95.31±30.60）pg/ml和（201.50±20.47）pg/ml,与CD19 CAR-T细胞和T细胞相比无统计学差异（P>0.05）。LMP1阳性细胞能刺激LMP1 CAR-T细胞释放IL-2与IFN-γ。6.单侧活体成像结果显示LMP1 CAR-T细胞在体内能抑制LMP1阳性鼻咽癌细胞移植瘤的增殖,与对照组具有统计学差异（P<0.05）。7.双侧活体成像结果显示LMP1 CAR-T细胞显着特异性抑制LMP1阳性鼻咽癌移植瘤的生长,而对LMP1阴性移植瘤无明显作用,与对照组具有统计学差异（P<0.05）。结论本研究成功构建第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,制备第三代LMP1CAR-T细胞,并证实LMP1 CAR-T细胞在体内外对LMP1阳性的鼻咽癌细胞具有增殖抑制作用。
黄骁辰[9]（2018）在《c-Met CAR-T细胞的制备及对肝癌细胞的杀伤作用》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）作为我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率居我国恶性肿瘤第三位,约占全球肝癌发病人数的45%,给我国人民的生命健康造成严重的危害。目前HCC的治疗以手术切除为主,但由于早期难以诊断,中晚期易有远处转移失去手术机会,放疗、化疗预后较差,因此免疫细胞治疗愈来愈受到重视。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞免疫治疗技术通过将抗体的高亲和力与T淋巴细胞的杀伤能力相结合,从而可特异性地靶向肿瘤组织高表达的抗原,对肿瘤细胞进行杀伤。经历多年的技术发展,CAR-T细胞免疫治疗已在血液系统恶性肿瘤取得了突破性进展,但在实体肿瘤的治疗方面还未见到明显疗效。其中合适的靶抗原选择对CAR-T细胞的治疗至关重要。c-Met作为肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）受体,在肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌等肿瘤组织中异常高表达,而在正常组织及癌旁非肿瘤组织中低水平表达或不表达。HCC中高表达的c-Met通过与配体HGF结合,可持续性激活HGF/c-Met信号通路,使得肝癌细胞异常增殖,抑制其凋亡并增强其迁移与侵袭能力。因此c-Met可以成为肝细胞癌免疫治疗的潜在分子靶点。本文在前期制备的全人源c-Met Fab抗体基础之上,通过构建c-Met CAR慢病毒载体,转染T淋巴细胞制备c-Met CAR-T细胞,观察其对c-Met阳性肝癌细胞的杀伤作用,为肝癌的临床治疗提供新的免疫细胞治疗方法。研究方法:1.以前期实验室制备的具有高亲和力的全人源抗c-Met Fab为模板,利用基因工程技术制备抗c-Met scFv,将c-Met sc Fv段与含有CD8TM,CD28,CD137,CD3ζ的慢病毒载体重组,构建三代c-Met CAR慢病毒载体,并以此为模板构建二代c-Met CAR慢病毒载体。基因测序验证所构建的c-Met CAR慢病毒表达载体的正确性。采用PEI转染试剂将c-Met CAR慢病毒载体质粒转染至X-293T细胞中,通过Western blot检验其在X-293T细胞中的表达。运用病毒包装技术包装制备c-Met CAR慢病毒,运用PEG-8000对病毒进行浓缩,并通过批量快速病毒滴度法检测病毒滴度。2.使用淋巴细胞分离液对健康志愿者的外周血进行分离,提取外周血中的PBMC,使用抗CD3抗体、抗CD28抗体对PBMC进行激活,加入IL-2促进细胞扩增,获得活化的T淋巴细胞。将c-Met CAR转染至T淋巴细胞,制备c-Met CAR-T细胞,采用流式细胞术检测其感染效率。3.通过流式细胞术筛选出c-Met表达阳性的肝癌细胞株。通过细胞免疫荧光的方法标记HepG2细胞,并与c-Met CAR-T细胞共培养12 h,观察与CAR-T细胞的结合情况。采用CCK-8法检测c-Met CAR-T细胞在不同效靶比时对肝癌细胞株HepG2,Bel-7402的杀伤作用,比较在效靶比为10:1时对shMet-HepG2的杀伤作用。将活化的T细胞与CD19 CAR-T细胞设立对照。4.制备的c-Met CAR-T细胞与c-Met阳性肝癌细胞共培养24h后,收集培养上清,通过ELISA法检测c-Met CAR-T细胞在c-Met阳性肝癌细胞的刺激下,细胞因子IL-2与IFN-γ的分泌情况。将活化的T细胞与CD19 CAR-T细胞设立对照。5.筛选Luciferase标记的HepG2细胞稳定株,小鼠单侧腋下成瘤后,于瘤旁注射c-Met CAR-T细胞,每次注射前进行活体成像,检测c-Met CAR-T细胞在体内对肝癌的抑制作用。研究结果:1.成功构建三代c-Met CAR慢病毒载体质粒（c-Met-28-137-3ζ）,并以此为模板构建了二代c-Met CAR慢病毒载体质粒（c-Met-28-3ζ、c-Met-137-3ζ）,基因测序结果显示质粒序列与设计序列一致。Western blot检测CD3ζ的表达,条带大小与理论值一致。结果显示各c-Met CAR慢病毒载体质粒可在真核细胞X-293T细胞内有效表达。包装制备c-Met CAR慢病毒并进行浓缩,浓缩后的病毒滴度约为5×108 IFU/ml。2.慢病毒感染活化后的T细胞,制备c-Met CAR-T细胞。流式细胞术检测结果显示c-Met CAR在T细胞中的表达率为46.3%57%。3.通过流式细胞术筛选出高表达c-Met的肝癌细胞株HepG2与Bel-7402。CCK-8结果显示,在效靶比为20:1,10:1,5:1,2:1时,三代c-Met CAR-T细胞对HepG2细胞的杀伤效率分别为80.23±4.04%、72.4±2.42%、60.93±2.3%、53.07±3.11%,c-Met CAR-T细胞的杀伤效率均与CD19 CAR-T细胞和活化的T细胞具有统计学差异（P<0.05）。与二代c-Met CAR-T细胞相比没有统计学差异（P>0.05）。在效靶比为10:1时,c-Met CAR-T细胞对低表达c-Met的sh Met-HepG2细胞的杀伤能力低于高表达c-Met的Hep G2细胞（P<0.05）,而CD19 CAR-T细胞与活化的T细胞对HepG2与shMet-HepG2细胞的杀伤能力无统计学差异（P>0.05）。4.ELISA结果显示,在效靶比为10:1时,c-Met-28-137-3ζ、c-Met-137-3ζ、c-Met-28-3ζCAR-T细胞与HepG2细胞共培养后,细胞上清IFN-γ含量分别为2066.7±251.66 pg/ml、2013.2±202.5 pg/ml、1606.7±275.92 pg/ml,结果表明拥有共刺激因子CD137的二代以及三代c-Met CAR-T细胞分泌的IFN-γ量与没有共刺激因子CD137的二代c-Met CAR-T细胞相比有统计学差异（P<0.05）。上述各组培养上清中的IL-2的含量分别为1496.67±230.29 pg/ml、1133.33±61.1 pg/ml、1273.33±46.19 pg/ml,结果表明三代c-Met CAR-T细胞分泌的IL-2高于二代c-Met CAR-T细胞分泌的IL-2（P<0.05）。而c-Met CAR-T细胞与低表达c-Met的shMet-HepG2共培养时分泌的IFN-γ与IL-2低于与高表达c-Met的HepG2细胞共培养时的分泌量（P<0.05）。5.活体成像结果显示,c-Met CAR-T细胞在体内能抑制HepG2细胞的增殖,c-Met-28-137-3ζCAR-T细胞组、c-Met-137-3ζCAR-T细胞组、c-Met-28-3ζCAR-T细胞组与活化的T细胞组在体内实验的抑瘤率分别为65.3%、49.8%、43.1%、6.7%。c-Met CAR-T细胞组抑制效果高于对照组（P<0.05）,三代c-Met CAR-T细胞抑制效果高于二代c-Met CAR-T细胞（P<0.05）。结论:1.构建了三代c-Met CAR（c-Met-28-137-3ζ）、二代c-Met CAR（c-Met-28-3ζ、c-Met-137-3ζ）慢病毒表达载体,包装制备c-Met CAR慢病毒,制备了三代、二代c-Met CAR-T细胞。2.三代、二代c-Met CAR-T细胞可特异性地杀伤c-Met阳性的肝癌细胞,能够分泌细胞因子IFN-γ与IL-2。并且随着靶细胞c-Met表达量的降低,c-Met CAR-T细胞的杀伤能力与细胞因子分泌也随之下降。3.c-Met CAR-T细胞能够在体内有效抑制c-Met阳性肝癌的生长,三代c-Met CAR-T细胞比二代c-Met CAR-T可更有效地抑制肝癌生长。
白欣艳[10]（2017）在《ANKRD49通过NF-κB信号通路抑制UV诱导小鼠精原细胞凋亡的初步研究》文中研究指明目的:运用分子克隆技术构建ankrd49真核表达重组质粒并建立ankrd49稳定过表达的小鼠精原细胞系（GC-1）细胞模型;分析ankrd49过表达对UV诱导GC-1细胞凋亡的影响,探讨NF-κB信号通路是否参与ANKRD49对UV诱导GC-1细胞凋亡的调控,并进一步探讨ANKRD49蛋白激活NF-κB信号通路的具体机制,为深入研究该基因的作用及其在精子发生中的调控机制提供思路。方法:1.利用分子克隆技术构建ankrd49真核表达重组质粒pMSCVpuro-ankrd49-flag;2.建立ankrd49稳定过表达的GC-1细胞模型,并采用RT-PCR和Western blotting检测ankrd49 mRNA和蛋白质的表达水平;3.通过Hoechst33258染色对紫外线（UV）诱导的GC-1细胞凋亡状况进行分析;4.运用流式细胞术检测过表达ankrd49基因对UV诱导的GC-1细胞凋亡率和线粒体膜电位下降率的影响;5.运用Caspase-3酶活性检测试剂盒检测过表达ankrd49基因对GC-1细胞Caspase-3酶活性的影响;6.利用Western blotting检测过表达ankrd49基因后GC-1细胞内凋亡相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶—PARP（poly ADP-ribose polymerase）、Cleaved-Caspase-3、Bcl-xL和Bax的表达变化;7.利用流式细胞术、caspase-3酶活性检测试剂盒和免疫印迹技术分别检测过表达ankrd49的gc-1细胞中加入nf-κb信号通路抑制剂（pdtc）后,gc-1细胞的凋亡率、caspase-3酶活性和凋亡相关蛋白parp、cleaved-caspase-3、bcl-xl和bax的表达变化情况;8.分别提取过表达组和空载体组细胞胞浆总蛋白和核蛋白,并采用westernblotting检测p65蛋白的亚细胞定位。结果:1.pcr扩增、双酶切分析及dna序列测定结果均表明真核表达重组质粒pmscvpuro-ankrd49-flag构建成功;2.rt-pcr和westernblotting检测结果显示ankrd49基因在gc-1细胞中实现了稳定过表达;3.hoechst33258染色结果显示,ankrd49稳定过表达组细胞的凋亡百分比为（0.03±0.01）×100%,明显低于空载体组（0.23±0.05）×100%和裸细胞组（0.25±0.04）×100%,（p<0.01）;4.流式细胞术结果显示过表达ankrd49组细胞的早期凋亡率为2.71%±0.50%,明显低于空载体组11.66%±1.01%和裸细胞组11.31%±1.74%,过表达ankrd49组细胞的线粒体膜电位下降率为11.51%±1.53%,明显低于空载体组和裸细胞组（30.54%±2.42%和28.99%±1.61%）,（p<0.01）;5.caspase-3酶活性实验结果显示过表达ankrd49组细胞caspase-3酶活性为1.09±0.15,明显低于空载体组（3.01±0.32）和裸细胞组（3.12±0.23）,（p<0.01）;6.westernblotting检测结果显示ankrd49稳定过表达组cleaved-parp、cleaved-caspase-3蛋白的表达水平明显低于对照组,而bcl-xl蛋白表达水平显着高于对照组;7.过表达ankrd49的gc-1细胞中加入nf-κb信号通路抑制剂（pdtc）后,经过流式细胞术检测表明pdtc处理组细胞早期凋亡率明显高于pdtc未处理组（p<0.01）,caspase-3酶活性实验结果显示pdtc处理组caspase-3酶活性明显升高（p<0.01）,westernblotting检测结果显示pdtc处理组细胞内cleaved-parp、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平明显增高,而Bcl-x L蛋白表达水平明显降低（P<0.05）;8.提取空载体组和过表达组细胞胞浆和核蛋白进行Western blotting检测,结果表明ANKRD49可以促进p65蛋白入核（P<0.01）。结论:1.成功构建了ankrd49的真核表达重组质粒,并建立ankrd49稳定过表达GC-1细胞模型。2.ANKRD49蛋白对UV诱导GC-1细胞凋亡具有抑制作用。3.ANKRD49蛋白通过激活NF-κB信号通路抑制GC-1细胞凋亡。
二、STUDIES ON THE DETECTION KIT FOR THE COLORECTAL CARCINOMA ASSOCIATED LARGE EXTERNAL ANTIGEN（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、STUDIES ON THE DETECTION KIT FOR THE COLORECTAL CARCINOMA ASSOCIATED LARGE EXTERNAL ANTIGEN（论文提纲范文）
（1）基于巨噬细胞极化观察白术内酯Ⅱ对胃癌细胞的作用（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MTT比色法检测细胞活性 |
| 2.2 光镜观察及MTT比色法检测细胞增殖 |
| 2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 2.4 FCM检测细胞极化 |
| 2.5 Real-time PCR检测相关基因表达水平 |
| 2.6 蛋白免疫印迹法（Western |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 白术内酯Ⅱ对巨噬细胞生长的影响 |
| 3.2 白术内酯Ⅱ作用后的巨噬细胞对SGC-7901胃癌细胞增殖的影响 |
| 3.3 白术内酯Ⅱ作用后的巨噬细胞对肿瘤细胞迁移能力的影响 |
| 3.4 白术内酯Ⅱ对巨噬细胞极化的影响 |
| 3.4.1 白术内酯Ⅱ对巨噬细胞极化特异性指标的影响 |
| 3.4.2 白术内酯Ⅱ对巨噬细胞极化相关基因的影响 |
| 3.4.3 白术内酯Ⅱ对巨噬细胞极化相关蛋白的影响 |
| 3.5 白术内酯Ⅱ对巨噬细胞PI3K磷酸化的影响 |
| 4 讨论 |
（2）KRAS蛋白p.G12S位点突变的单链抗体筛选及鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.KRAS基因相关突变概述 |
| 2.单链抗体应用的优点与不足 |
| 3.噬菌体抗体库技术的发展 |
| 4.本课题的主要研究工作及临床意义 |
| 文献回顾 |
| 1.KRAS基因在实体瘤的突变率 |
| 1.1 结直肠肿瘤 |
| 1.2 肺癌 |
| 1.3 胃癌 |
| 1.4 胰腺癌 |
| 1.5 其他肿瘤 |
| 2.KRAS基因突变致病的危险因素 |
| 3.噬菌体抗体库技术 |
| 3.1 噬菌体展示技术的发现 |
| 3.2 噬菌体展示技术的技术要点 |
| 3.3 构建噬菌体抗体库 |
| 3.4 抗体库的分类 |
| 3.5 噬菌体抗体库的筛选 |
| 3.6 噬菌体抗体库技术的应用 |
| 4.单链抗体技术 |
| 4.1 抗体的基本结构及发展历程 |
| 4.2 单链抗体的基本构造和制备方法 |
| 4.3 单链抗体的特点及局限性 |
| 4.4 单链抗体与CAR-T治疗 |
| 5.问题与展望 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 血样标本 |
| 1.2 噬菌粒及菌株 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 试剂配方 |
| 1.5 耗材 |
| 1.6 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 健康志愿者外周血淋巴细胞分离 |
| 2.2 人淋巴细胞总RNA的提取 |
| 2.3 合成1st strand cDNA |
| 2.4 第一轮PCR扩增目的基因 |
| 2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.6 扩增片段胶回收纯化 |
| 2.7 第二轮PCR扩增--连接肽和酶切位点的引入 |
| 2.8 第三轮PCR扩增--scFv基因组装 |
| 2.9 噬菌粒载体酶切 |
| 2.10 切后载体与切后scFv连接效率检测 |
| 2.11 电击转化 |
| 2.12 文库阳性率检测 |
| 2.13 噬菌体抗体库的制备和滴度测定 |
| 2.14 序列分析 |
| 2.15 特异性高亲和力抗体的表达及筛选 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA的提取 |
| 3.2 VH、VL和 VK基因的扩增 |
| 3.3 scFv基因的拼接 |
| 3.4 噬菌粒载体酶切 |
| 3.5 小试实验-切后载体与切后SCFV连接效率检测 |
| 3.6 电击转化 |
| 3.7 文库阳性率检测 |
| 3.8 噬菌体抗体库滴度测定 |
| 3.9 序列分析 |
| 3.10 抗体筛选滴度测定结果分析 |
| 3.11 单克隆phage ELISA结果分析 |
| 3.12 阳性克隆测序分析 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（3）TNF-α对Tc9细胞分化和抗肿瘤作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写对照 |
| 绪论 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 过继免疫治疗 |
| 1.1.1 简介 |
| 1.1.2 过继免疫治疗的效应细胞及其应用 |
| 1.1.3 过继免疫治疗面临的问题 |
| 1.2 TNF-α及其受体 |
| 1.2.1 简介 |
| 1.2.2 TNF-α发挥生物学作用的相关机制 |
| 1.2.3 TNF-α在疾病中的作用 |
| 1.3 Tc9 细胞 |
| 1.3.1 简介 |
| 1.3.2 Tc9 细胞与 IL-9 |
| 第2章 TNF-α对 Tc9 细胞的体外诱导作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验耗材与设备 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Tc细胞的体外培养 |
| 2.2.2 Q-PCR |
| 2.2.3 流式细胞术 |
| 2.2.4 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 TNF-α促进Tc9 细胞的体外生成 |
| 2.3.2 TNF-α对 Tc9 细胞体外活性的影响 |
| 2.3.3 TNF-α对 Tc9 细胞的体外增殖和凋亡的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 TNF-α对 Tc9 细胞的体内抗肿瘤效应的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 细胞与肽 |
| 3.1.3 实验主要试剂 |
| 3.1.4 主要实验仪器与设备 |
| 3.1.5 实验试剂的配制 |
| 3.1.6 引物序列 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Tc9 细胞的体外培养 |
| 3.2.2 细胞过继免疫治疗 |
| 3.2.3 Q-PCR |
| 3.2.4 流式细胞术 |
| 3.2.5 Tc细胞体内浸润实验 |
| 3.2.6 Tc细胞体内杀伤实验 |
| 3.2.7 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TNF-α增强Tc9 细胞的体内抗肿瘤能力 |
| 3.3.2 TNF-α增强Tc9 细胞的浸润能力 |
| 3.3.3 TNF-α促进Tc9 细胞的体内杀伤能力 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 TNF-α诱导Tc9 细胞的作用机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验主要试剂 |
| 4.1.3 主要实验器材与设备 |
| 4.1.4 主要实验试剂的配制 |
| 4.1.5 引物序列 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Tc细胞的体外培养 |
| 4.2.2 Q-PCR |
| 4.2.3 流式细胞术 |
| 4.2.4 Western Blot |
| 4.2.5 统计学方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 TNF-α通过TNFR2 促进Tc9 细胞的生成 |
| 4.3.2 TNF-α通过TNFR2对Tc9 细胞凋亡和增殖的作用 |
| 4.3.3 STAT5与NF-κB信号通路参与TNF-α促进Tc9 细胞生成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新与特色 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一 天然药物调控自噬治疗肿瘤及基于益气活血解毒理论的应用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬影响肿瘤发生与转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 肝素酶与血管生成相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述四 三阴性乳腺癌肿瘤异质性与治疗研究进展 |
| 辨文献 |
| 第二部分 乙酰肝素酶对MDA-MB-231乳腺癌肿瘤生长、自噬、血管生成的干预作用 |
| 实验一 乙酰肝素酶对乳腺癌患者生存情况的影响分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 乙酰肝素酶对MDA-MB-231细胞自噬水平的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 MDA-MB-231乳腺癌乳垫原位移植瘤模型建立以及乙酰肝素酶表达水平对体内肿瘤生长及血管生成的干预作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 益气活血解毒中药对HPSE高表达乳腺癌体内外的干预作用及自噬及血管生成方面的机制研究 |
| 实验一 SANT对乳腺癌细胞生长的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 SANT对乳腺癌细胞迁移的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 SANT对乳腺癌细胞肝素酶表达及自噬的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四 SANT对小鼠肿瘤生长的抑制作用及安全性评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验五 SANT对肿瘤血管生成的干预作用及机制分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验六 SANT对肿瘤组织自噬相关基因表达的影响及分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）靶向肺癌LunX的CAR-T细胞治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤的细胞治疗发展 |
| 1.1.1 干细胞治疗 |
| 1.1.2 CIK细胞治疗 |
| 1.1.3 NK细胞治疗 |
| 1.1.4 T细胞治疗 |
| 1.1.4.1 肿瘤浸润T细胞 |
| 1.1.4.2 TCR-T细胞 |
| 1.2 CAR-T细胞治疗 |
| 1.2.1 CAR-T细胞的研究现状 |
| 1.2.1.1 CD28与4-1BB共刺激的比较 |
| 1.2.1.2 第一代CAR-T |
| 1.2.1.3 第二代CAR-T |
| 1.2.1.4 第三代CAR-T |
| 1.2.1.5 第四代CAR-T |
| 1.2.2 CAR-T治疗血液瘤 |
| 1.2.3 CAR-T治疗实体瘤 |
| 1.2.3.1 CAR-T治疗实体瘤的现状 |
| 1.2.3.2 CAR-T治疗实体瘤面临的挑战 |
| 1.3 肺癌 |
| 1.3.1 导致肺癌的原因 |
| 1.3.1.1 吸烟 |
| 1.3.1.2 氡气 |
| 1.3.1.3 石棉 |
| 1.3.1.4 空气污染 |
| 1.3.1.5 遗传因素 |
| 1.3.2 肺癌的诊断 |
| 1.3.2.1 胸部X光检查 |
| 1.3.2.2 电子计算机体层扫描(CT) |
| 1.3.2.3 核磁共振(MRI) |
| 1.3.2.4 痰脱落细胞的检查 |
| 1.3.2.5 纤维支气管检查(纤支镜) |
| 1.3.2.6 开胸手术检查 |
| 1.3.2.7 其他检查 |
| 1.3.3 肺癌分类 |
| 1.3.4 肺癌相关的基因突变 |
| 1.3.4.1 RAS |
| 1.3.4.2 MYC |
| 1.3.4.3 BCL-2 |
| 1.3.4.4 NOTCH-3 |
| 1.3.4.5 AIS |
| 1.3.5 目前肺癌的治疗方法 |
| 1.3.5.1 手术 |
| 1.3.5.2 放疗 |
| 1.3.5.3 化疗 |
| 1.3.5.4 靶向抗体治疗 |
| 1.3.6 肺癌和LunX |
| 1.3.7 目前针对于肺癌的CAR-T细胞治疗 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 实验材料与方法 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 小鼠实验相关试剂 |
| 3.2.2 T细胞分离以及活化相关试剂 |
| 3.2.3 细胞系 |
| 3.2.4 细胞培养相关试剂 |
| 3.2.5 流式细胞术相关试剂 |
| 3.2.6 细胞增殖检测相关试剂 |
| 3.2.7 提取RNA以及逆转录PCR相关试剂 |
| 3.2.8 分子克隆技术相关试剂 |
| 3.2.9 转染以及包装浓缩病毒相关试剂 |
| 3.2.10 免疫荧光相关试剂 |
| 3.2.11 蛋白质分子生物学相关试剂 |
| 3.2.12 免疫组化相关试剂 |
| 3.2.13 ELISA相关试剂 |
| 3.3 实验器材 |
| 3.3.1 通用实验器材 |
| 3.3.2 细胞培养实验器材 |
| 3.3.3 分子克隆实验器材 |
| 3.3.4 Western blot实验器材 |
| 3.3.5 动物实验实验器材 |
| 3.3.6 流式细胞术相关器材 |
| 3.3.7 免疫组织化学相关器材 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 细胞分离,复苏,培养和冻存 |
| 3.4.1.1 人外周血T细胞分离 |
| 3.4.1.2 人外周血T细胞培养与活化 |
| 3.4.1.3 细胞系的复苏 |
| 3.4.1.4 贴壁细胞的培养 |
| 3.4.1.5 细胞冻存 |
| 3.4.1.6 Cell trace violet标记细胞 |
| 3.4.2 质粒的提取 |
| 3.4.3 RNA的提取 |
| 3.4.4 逆转录 |
| 3.4.5 PCR |
| 3.4.6 感受态转化及阳性克隆筛选 |
| 3.4.7 慢病毒的包装、收集以及浓缩 |
| 3.4.8 T细胞的活化以及慢病毒的感染 |
| 3.4.9 Western Blotting |
| 3.4.10 免疫组化 |
| 3.4.11 RTCA检测杀伤 |
| 3.4.12 流式细胞术 |
| 3.4.13 免疫荧光 |
| 3.4.14 细胞因子的检测 |
| 3.4.15 小鼠模型构建 |
| 3.4.16 提取小鼠基因组DNA |
| 3.4.17 抗体的制备与纯化 |
| 3.4.17.1 收集培养上清 |
| 3.4.17.2 制备腹水 |
| 3.4.17.3 纯化抗体 |
| 3.4.18 统计分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 实验结果 |
| 4.1.1 构建CAR~(LunX)表达载体 |
| 4.1.2 慢病毒成功感染CAR~(LunX)T细胞 |
| 4.1.3 LunX抗原可以刺激CAR~(LunX)T细胞产生细胞因子 |
| 4.1.4 非小细胞肺癌细胞膜表达LunX蛋白 |
| 4.1.5 CAR~(LunX)T细胞可以靶向杀伤非小细胞肺癌细胞 |
| 4.1.6 LunX~+细胞可以特异性活化CAR~(LunX) T细胞效应功能 |
| 4.1.7 CAR~(LunX) T细胞抑制肺癌的生长 |
| 4.1.8 CAR~(LunX) T细胞抑制PDX模型肿瘤的生长 |
| 4.2 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
（6）经血间充质干细胞对肝癌细胞表观调控机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 MenSC对肝癌细胞生长抑制作用伴随表观催化酶的改变 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 MenSC表面标志及三系分化潜能的鉴定 |
| 1.4.2 MenSC在体外抑制肝癌细胞的生长 |
| 1.4.3 MenSC在体外对肝癌细胞的抑制作用伴随着表观遗传学的改变 |
| 1.4.4 MenSC在体内对肝癌细胞生长具有抑制作用且伴随表观层面的改变 |
| 1.5 讨论 |
| 第二部分 MenSC影响肝癌细胞全基因组甲基化和羟甲基化修饰水平 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 经MenSC治疗肝癌细胞表现出特异的全基因组甲基化及羟甲基化谱 |
| 2.4.2 联合RNA-seq技术探讨MenSC对肝癌细胞转录水平的影响 |
| 2.4.3 hMeDIP-seq、MeDIP-seq和RNA-seq联合分析筛选治疗相关靶基因 |
| 2.5 讨论 |
| 第三部分 MenSC调控增强子5-hmC和5-mC抑制肝癌细胞PI3K/AKT和MAPK通路 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MenSC调控PI3K/AKT通路关键基因的增强子、启动子表观修饰 |
| 3.4.2 MenSC影响PI3K/AKT/FOXO通路表达激活下游凋亡功能 |
| 3.4.3 MenSC通过抑制PI3K/AKT通路促进肝癌细胞凋亡功能 |
| 3.4.4 MenSC通过增强子区域的表观修饰抑制MAPK通路 |
| 3.4.5 MenSC下调ERK通路关键基因抑制C-MYC介导的EMT |
| 3.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及博士期间研究成果 |
（7）母乳婴儿源益生菌筛选及其干预炎症性肠病的免疫效应和相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 母乳婴儿源益生菌 |
| 1.1.1 通过母乳喂养母亲肠道菌群在母亲-新生儿之间的垂直转移 |
| 1.1.2 益生菌与婴儿健康 |
| 1.1.3 母乳婴儿源益生菌的国内外研究进展 |
| 1.2 益生菌与肠道性疾病:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC) |
| 1.2.1 肠道稳态维持免疫机制 |
| 1.2.2 炎症性肠病中肠道菌群与宿主免疫反应的影响因素 |
| 1.2.3 针对IBD肠道菌群的潜在治疗方案 |
| 1.2.4 益生菌对溃疡性结肠炎的保护机制 |
| 1.2.5 组学在炎症性肠病中的应用 |
| 1.2.6 益生菌缓解溃疡性结肠炎及其作用机制的国内外研究进展 |
| 2 本研究的目的意义、研究内容及技术路线 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 3 本研究预期创新点 |
| 第二章 母乳婴儿源益生菌的筛选及初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 样品来源及采集标准 |
| 1.1.2 菌株来源 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器与设备 |
| 1.1.5 主要培养基的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 样本采集 |
| 1.2.2 乳酸菌的分离、纯化及保藏 |
| 1.2.3 具有潜在益生特性乳酸菌的筛选 |
| 1.2.4 菌株的鉴定 |
| 1.2.5 菌株体外安全性评价 |
| 1.2.6 菌株体外益生特性评价 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株的筛选 |
| 2.1.1 耐酸菌株的筛选 |
| 2.1.2 菌株对人工消化液耐受性 |
| 2.1.3 菌株对胆盐的耐受性 |
| 2.1.4 菌株对Caco-2细胞的黏附性能 |
| 2.2 菌株BF_15的鉴定 |
| 2.2.1 BF_15的菌落、菌体形态及生理生化特性 |
| 2.2.2 BF_15的16S rRNA基因序列分析 |
| 2.3 菌株BF_15的安全性评价 |
| 2.3.1 药敏试验 |
| 2.3.2 质粒验证 |
| 2.3.3 有害代谢产物 |
| 2.3.4 溶血试验 |
| 2.4 菌株BF_15体外益生功能评价 |
| 2.4.1 BF_15体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 |
| 2.4.2 菌株H_2O_2耐受能力 |
| 2.4.3 BF_15体外抗氧化能力评价 |
| 3 讨论 |
| 3.1 益生菌的初筛及鉴定 |
| 3.2 菌株BF_15的体外安全性评价 |
| 3.3 菌株BF_15的体外益生功能评价 |
| 3.3.1 BF_15体外免疫调节能力_ |
| 3.3.2 BF_15体外抗氧化能力 |
| 本章小结 |
| 第三章 母乳婴儿源益生菌:植物乳杆菌BF_15通过调节肠道菌群缓解环磷酰胺诱发免疫抑制的研究 |
| 第一节 植物乳杆菌BF_15在小鼠体内的定植能力研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 试剂及工具酶 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 菌悬液的制备 |
| 1.2.2 小鼠的饲养及分组 |
| 1.2.3 基因组DNA提取 |
| 1.2.4 细菌rpo B可变区的PCR扩增 |
| 1.2.5 BF_15肠道定植的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品基因组提取及基于rpo B特异性引物的PCR扩增 |
| 2.2 BF_15在小鼠肠道定植情况的DGGE电泳图谱分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 植物乳杆菌BF_15通过调节肠道菌群缓解环磷酰胺诱发的小鼠免疫抑制的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BF_15对免疫抑制小鼠的调节功能测定 |
| 1.2.2 BF_15对免疫抑制小鼠肠道菌群影响的测定 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BF_15对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 |
| 2.2 BF_15对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响 |
| 2.2.1 不同处理组样本提取基因组的质量评估 |
| 2.2.2 不同处理组样本高通量测序质量评估 |
| 2.2.3 不同处理组样本肠道菌群分布情况 |
| 2.2.4 不同处理组样本肠道菌群结构组成 |
| 2.2.5 基于picmst 16S测序的肠道菌群功能预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BF_15对免疫抑制小鼠的免疫调节能力 |
| 3.2 BF_15对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响 |
| 3.2.1 对免疫抑制小鼠肠道菌群结构组成的影响 |
| 3.2.2 对肠道微生物群落功能的影响 |
| 本章小结 |
| 第四章 母乳婴儿源益生菌:植物乳杆菌BF_15干预炎症性肠病及其作用机理研究 |
| 第一节 植物乳杆菌BF_15缓解DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的效应评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 动物模型的优化 |
| 1.2.2 BF_15缓解DSS诱导小鼠结肠炎症能力的测定 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 动物模型的优化 |
| 2.1.1 DAI评分 |
| 2.1.2 结肠长度及组织学损伤的评估 |
| 2.1.3 考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度标准曲线 |
| 2.1.4 氧化应激及能量代谢指标 |
| 2.1.5 血清中炎症因子及sIgA含量的测定 |
| 2.1.6 两组UC模型各指标数据离散度比较 |
| 2.2 BF_15对DSS诱导小鼠结肠炎症的缓解作用 |
| 2.2.1 DAI评分 |
| 2.2.2 小鼠结肠长度及组织学损伤评价 |
| 2.2.3 氧化应激及能量代谢指标的评价 |
| 2.2.4 炎症因子及sIgA含量的评价 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DSS诱导溃疡性结肠炎模型的优化 |
| 3.2 BF_15缓解DSS诱导UC |
| 3.2.1 BF_15对UC小鼠及结肠炎症的缓解 |
| 3.2.2 BF_15对UC小鼠结肠氧化损伤及能量代谢障碍的影响 |
| 3.2.3 BF_15对UC小鼠免疫功能的影响 |
| 第二节 植物乳杆菌BF_15对DSS诱导小鼠肠道菌群紊乱调节的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌悬液的制备 |
| 1.2.2 动物分组 |
| 1.2.3 粪便样品采集 |
| 1.2.4 高通量测序试验流程 |
| 1.2.5 生物信息学分析及数据统计学处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同处理组样本基因组质量评估 |
| 2.2 不同处理组样本高通量测序质量评估 |
| 2.3 不同处理组肠道菌群分布情况 |
| 2.4 不同处理组小鼠肠道菌群结构组成 |
| 2.5 基于picmst 16s测序的肠道菌群功能预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BF_15对肠道微生物群落结构的影响 |
| 3.2 BF_15对肠道微生物群落功能的影响 |
| 第三节 基于蛋白质组学解析植物乳杆菌BF_15通过调节肠道菌群缓解溃疡性结肠炎的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌悬液的制备 |
| 1.2.2 动物分组 |
| 1.2.3 结肠组织的采集 |
| 1.2.4 不同处理组样本差异表达蛋白测序流程 |
| 1.2.5 蛋白质组学的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蛋白定量及质量检测 |
| 2.2 差异蛋白的鉴定与定量 |
| 2.3 差异表达蛋白主成分分析 |
| 2.4 结肠组织中UC差异表达蛋白的生物信息学分析 |
| 2.4.1 GO注释与GO富集分析 |
| 2.4.2 KEGG注释与KEGG富集分析 |
| 2.5 结肠组织中益生菌(BF_15/LGG)干预UC差异表达蛋白的生物信息学分析 |
| 2.5.1 益生菌(BF_15/LGG)干预UC差异表达蛋白的GO注释 |
| 2.5.2 益生菌(BF_15/LGG)干预UC差异表达蛋白的GO富集 |
| 2.5.3 益生菌(BF_15/LGG)干预UC差异表达蛋白KEGG注释富集分析 |
| 2.6 UC和益生菌(BF_15/LGG)干预UC小鼠的结肠蛋白质组学联合分析 |
| 2.6.1 结肠组织中UC和益生菌(BF_15/LGG)干预UC差异表达蛋白联合分析 |
| 2.6.2 结肠组织中UC与益生菌(BF_15/LGG)干预UC差异表达蛋白KEGG富集通路联合分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 益生菌(BF_15/LGG)干预UC直接回调蛋白 |
| 3.2 益生菌(BF_15/LGG)干预UC直接作用的信号通路:抗原的加工与提呈 |
| 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）第三代LMP1 CAR-T细胞的制备及对鼻咽癌细胞杀伤作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 第三代LMP1CAR慢病毒表达载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 第三代LMP1CAR-T细胞的制备及其对鼻咽癌细胞的杀伤作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 硕士学位在读期间发表论文及参与科研工作 |
| 致谢 |
（9）c-Met CAR-T细胞的制备及对肝癌细胞的杀伤作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 c-MetCAR慢病毒表达载体的构建及c-MetCAR-T细胞的制备材料与方法 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 c-MetCAR-T细胞对肝癌细胞的杀伤作用材料与方法 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 硕士学位在读期间发表论文及参与科研工作 |
| 致谢 |
（10）ANKRD49通过NF-κB信号通路抑制UV诱导小鼠精原细胞凋亡的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 ankrd49真核表达重组质粒的构建及其对UV诱导GC-1 细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR扩增ankrd49基因 |
| 2.2 pMSCVpuro-ankrd49-flag真核表达重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 重组质粒pMSCVpuro-ankrd49-flag在GC-1 细胞中的稳定表达 |
| 2.4 Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡形态 |
| 2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.6 流式细胞术检测线粒体膜电位变化 |
| 2.7 Caspase-3 酶活性检测 |
| 2.8 Western blotting检测Cleaved-Caspase-3 和PARP的表达 |
| 2.9 Western blotting检测Bcl-xL和Bax的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 ANKRD49通过NF-κB信号通路抑制UV诱导GC-1 细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 NF-κB信号通路抑制剂在ANKRD49对UV诱导GC-1 所致凋亡中的作用 |
| 2.1.1 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.1.2 Caspase-3 酶活性检测 |
| 2.1.3 Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.2 Western blotting检测p65蛋白入核情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、STUDIES ON THE DETECTION KIT FOR THE COLORECTAL CARCINOMA ASSOCIATED LARGE EXTERNAL ANTIGEN（论文参考文献）
- [1]基于巨噬细胞极化观察白术内酯Ⅱ对胃癌细胞的作用[J]. 袁梦云,张星星,谢晓东,陈敏,王红星,吴坚,赵智强. 中国实验方剂学杂志, 2020(21)
- [2]KRAS蛋白p.G12S位点突变的单链抗体筛选及鉴定[D]. 刘浩聪. 西安医学院, 2020(08)
- [3]TNF-α对Tc9细胞分化和抗肿瘤作用的研究[D]. 杨思雨. 吉林大学, 2020(08)
- [4]益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨[D]. 李琦玮. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]靶向肺癌LunX的CAR-T细胞治疗[D]. 胡孜鸣. 中国科学技术大学, 2020(06)
- [6]经血间充质干细胞对肝癌细胞表观调控机制研究[D]. 吴怡晨. 浙江大学, 2019(03)
- [7]母乳婴儿源益生菌筛选及其干预炎症性肠病的免疫效应和相关机制研究[D]. 张娜. 河北农业大学, 2020(01)
- [8]第三代LMP1 CAR-T细胞的制备及对鼻咽癌细胞杀伤作用研究[D]. 陈渊. 南京医科大学, 2018(10)
- [9]c-Met CAR-T细胞的制备及对肝癌细胞的杀伤作用[D]. 黄骁辰. 南京医科大学, 2018(10)
- [10]ANKRD49通过NF-κB信号通路抑制UV诱导小鼠精原细胞凋亡的初步研究[D]. 白欣艳. 山西医科大学, 2017(02)