CRISPR/Cas9介导的外源基因在猪PSP位点的定点整合

论文摘要

唾液腺生物反应器作为一种新型生物反应器,是利用唾液分泌蛋白的调控区特异性表达各种外源蛋白,常用的唾液分泌蛋白为腮腺分泌蛋白（parotid secretory protein, PSP）。本研究旨在建立利用CRISPR/Cas9系统对猪（Sus scrofa） PSP基因定点整合的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对PSP基因整合的脱靶效应,筛选获得能够实现上述目标的有效的基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA。实验首先根据PSP基因序列在线设计单链引导RNA （single guiding RNA, sgRNA）,选出5条sgRNA序列;然后利用sgRNA体外转录试剂盒和Cas9体外酶切试剂盒,筛选出靶向PSP基因体外酶切活性较高的sg RNA序列,构建sgRNA和Cas9共表达载体pCas9-sgRNA,同时构建携带新霉素抗性基因（neomycin resistance gene, NeoR）表达结构的打靶载体pMD19-5’arm-NeoR-3’arm;最后将sgRNA和Cas9共表达载体和打靶载体共转染猪肾细胞（PK-15细胞）,利用新霉素进行筛选,分离单细胞克隆。通过PCR及测序鉴定NeoR定点敲入阳性单克隆细胞并进行脱靶效应分析。体外酶切结果表明,sgRNA1、sgRNA3、sgRNA4和sgRNA5均有较高的体外酶切活性;测序结果显示,4个sgRNA均成功针对猪PSP基因实现了定点敲入,sg RNA1、sgRNA5敲入效率分别为22.7%（5/22）和26.1%（6/23）,且均存在1个潜在脱靶位点发生了脱靶效应;sgRNA3、sgRNA4敲入效率分别为50.0%（12/24）和42.1%（8/19）,5个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。本研究成功建立了针对猪PSP基因进行基因编辑的方法体系,筛选出高效引导外源基因定点敲入猪PSP基因的sgRNA,为深入研究转基因猪提供了基础资料。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 靶向猪PSP基因的sgRNA设计与合成
•     1.2.2 sgRNA表达质粒的构建
•     1.2.3 sgRNA转录模板的PCR扩增与纯化
•     1.2.4 sgRNA模板的体外转录
•     1.2.5 体外切割底物的PCR扩增与纯化
•     1.2.6 sgRNA体外活性检测
•     1.2.7 sgRNA和Cas9共表达载体构建
•     1.2.8 打靶载体构建
•     1.2.9 CRISPR/Cas9系统和打靶载体共转染PK-15细胞及细胞单克隆筛选
•     1.2.1 0 猪PSP基因定点编辑结果分析
•     1.2.1 1 脱靶效应位点分析
• 2 结果与分析
•   2.1 sgRNA设计、扩增与纯化
•   2.2 体外检测sgRNA活性
•   2.3 sgRNA和Cas9共表达载体和打靶载体构建
•   2.4 阳性单克隆细胞筛选及猪PSP基因修饰分析
•   2.5 脱靶效应位点分析
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 靳伟,代敏敏,李德娟,樊宝良

关键词: 腮腺分泌蛋白基因,体外转录,脱靶效应

来源: 农业生物技术学报 2019年09期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北农业大学动物科技学院

基金: 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(No.2014ZX08006-005),国家自然科学基金(No.30972081),河北省科技支撑计划项目(No.14236602D-4(2014)),河北省现代农业产业技术体系蛋肉鸡产业创新团队遗传资源开发与利用岗位项目(No.HBCT2018150201)

分类号: Q78;S828

页码: 1569-1581

总页数: 13

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