全文摘要
本发明公开了一种活性增强子筛选载体及其构建方法，其基于逆转录病毒载体进行构建，从荧光素酶报告载体中获得微型启动子和mChery片段，并将所获得的微型启动子和mChery片段克隆至逆转录病毒载体中，获得活性增强子筛选载体。利用本发明方法构建的活性增强子筛选载体，只需将待筛选文库直接插入到载体特定位置即可直接进行活性增强子的筛选，大大简便了全基因组水平活性增强子的筛选，对研究增强子的作用机制具有重要意义。
主设计要求
1.一种活性增强子筛选载体的构建方法，其特征在于，基于逆转录病毒载体进行构建，从荧光素酶报告载体PGL4.3中获得微型启动子并通过基因合成mChery片段，并将所获得的微型启动子和mChery片段克隆至逆转录病毒载体中，获得活性增强子筛选载体。
设计方案
1.一种活性增强子筛选载体的构建方法，其特征在于，基于逆转录病毒载体进行构建，从荧光素酶报告载体PGL4.3中获得微型启动子并通过基因合成mChery片段，并将所获得的微型启动子和mChery片段克隆至逆转录病毒载体中，获得活性增强子筛选载体。
2.根据权利要求1所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其特征在于，所述荧光素酶报告载体为PGL4.23荧光素酶报告载体。
3.根据权利要求2所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其特征在于，所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体pMX-GFP。
4.根据权利要求3所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其特征在于，活性增强子筛选载体的构建方法具体包括：
S1、去除PGL4.23荧光素酶报告载体中原有的luc2报告基因，将mCherry基因连接到miniP后面；
S2、扩增miniP-mCherry片段，并将其连接至逆转录病毒载体pMX-GFP，用miniP-mCherry替换GFP基因，构建成最终的活性增强子筛选载体。
5.根据权利要求4所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：利用限制性内切酶XbaI\/NcoI通过双酶切去除PGL4.23荧光素酶报告载体中luc2报告基因的原始编码序列，将mCherry基因连接到miniP后面。
6.根据权利要求5所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：利用携带NcoI或NotI酶切位点的引物扩增miniP-mCherry片段，并通过这两个酶切位点将其连接至逆转录病毒载体pMX-GFP中，用miniP-mCherry替换GFP基因，最终获得活性增强子筛选载体。
7.一种活性增强子筛选载体，其特征在于，利用如权利要求1-6任一项所述的方法构建而成。
设计说明书
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种活性增强子筛选载体及其构建方法。
背景技术
真核生物的基因表达调控是个复杂的过程，其中受到多种转录调控元件的控制。其中增强子作为一种重要的顺式调控元件与启动子在空间形成环状并相互作用控制着靶基因的转录。生物体的基因组有大量的基因，这些基因在不同的时间空间上相互协作共同执行着调控生物体复杂的功能，那么基因组的基因在执行功能的时候增强子是如何变化的，所以全基因组的增强子鉴定就变得非常重要。目前，全基因组增强子的鉴定主要是依据增强子区域的表观遗传学特征，比如甲基化修饰，乙酰化修饰等；依赖此类特征的主要技术是以chip-seq为主。从chip-seq组蛋白标志鉴定的增强子来说，比如它需要有特异性很高的抗体以及生息分析的局限性导致了假阳性的存在。基于此，如果开发一种活性增强子筛选载体，只要将待筛选文库直接插入到载体的特定位置就可以直接进行活性增强子的筛选了，这种方法大大简便了全基因组水平活性增强子的筛选，对研究增强子的作用机制具有重要意义。
发明内容
本发明目的是针对上述问题，提供一种活性增强子筛选载体及其构建方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种活性增强子筛选载体的构建方法，其中，基于逆转录病毒载体进行构建，从荧光素酶报告载体中获得微型启动子和mChery片段，并将所获得的微型启动子和mChery片段克隆至逆转录病毒载体中，获得活性增强子筛选载体。
所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述荧光素酶报告载体为PGL4.23荧光素酶报告载体。
所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体pMX-GFP。
所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，活性增强子筛选载体的构建方法具体包括：
S1、去除PGL4.23荧光素酶报告载体中原有的luc2报告基因，将mCherry基因连接到miniP后面；
S2、扩增miniP-mCherry片段，并将其连接至逆转录病毒载体pMX-GFP，用miniP-mCherry替换GFP基因，构建成最终的活性增强子筛选载体。
所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述步骤S1具体为：利用限制性内切酶XbaI\/NcoI通过双酶切去除PGL4.23荧光素酶报告载体中luc2报告基因的原始编码序列，将mCherry基因连接到miniP后面；
所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述步骤S2具体为：利用携带NcoI或NotI酶切位点的引物扩增miniP-mCherry片段，并通过这两个酶切位点将其连接至逆转录病毒载体pMX-GFP中，用miniP-mCherry替换GFP基因，最终获得活性增强子筛选载体。
一种活性增强子筛选载体，其中，利用如上所述的方法构建而成。
有益效果：
本发明提供一种活性增强子筛选载体及其构建方法，利用该方法构建的活性增强子筛选载体，只需将待筛选文库直接插入到载体特定位置即可直接进行活性增强子的筛选，大大简便了全基因组水平活性增强子的筛选，对研究增强子的作用机制具有重要意义。
附图说明
图1为本发明本发明具体实施例中活性增强子筛选载体图谱；
图2为本发明实验原理流程图；
图3为本发明具体实施例中利用XhOI和Hind III对增强子筛选表达载体酶切后琼脂糖凝胶电泳检图；
图4为本发明具体实施例中同源重组质粒pmx-mp-N25-mchery琼脂糖凝胶电泳检图；
图5为本发明随机序列文库转染细胞荧光图。
图6为本发明细胞流式筛选富集结果。
图7为本发明两步法建库测序琼脂糖凝胶电泳检图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明活性增强子筛选载体(pMX-miniP-mCherry)是基于改良的逆转录病毒载pMX-GFP改造的(Cell Biolabs,USA)。其中miniP为微小启动子，来源于pGL4.23载体。mCherry红色荧光报告基因，其序列通过基因合成得到。具体为：从改良的PGL4.23荧光素酶报告载体(Promega,USA)中获得微型启动子(mini-promoter)和mChery片段。首先用限制性内切酶XbaI\/NcoI消化PGL4.23，去除luc2报告基因的原始编码序列，将mCherry基因连接到miniP后面，然后利用携带NcoI或NotI酶切位点的引物扩增miniP-mCherry片段，并通过这两个酶切位点将其连接至pMX-GFP载体，最终获得活性增强子筛选载体命名为pMX-miniP-mCherry，如图1所示。
如果在miniP上游连接了增强子序列，即能启动mCherry报告基因的表达。
如图2所示，本发明将随机合成序列(20-50bp)同源重组到mini启动子的上游，如果随机序列有增强子活性将激活下游报告基因mChery的表达，通过流式富集把增强子阳性细胞筛选下来，通过建库再去高通量测序得到增强子序列。
活性增强子筛选过程大致如下：
1、构建活性增强子的筛选文库；
2、将筛选文库构建到活性增强子筛选载体上；
3、筛选文库进行细胞转染；
4、流式细胞仪进行阳性细胞富集；
5、高通量测序鉴定增强子序列。
具体实验过程如下：
1、随机序列文库的合成：25bp长随机序列文库委托金唯智生物科技有限公司合成。
随机文库稀释：12000g，RT，离心90s，加无菌水稀释成浓度为50ng\/ul的溶液。
2、载体线性化
2.1载体双酶切
利用XhOI(NEB.Cat.No.R0146V)和Hind III(NEB.Cat.No.R0104b)在NEBuffer2.1(NEB.Cat.No.B7202S)缓冲液中对活性增强子筛选载体进行酶切，酶切后序列电泳图如图3所示，酶切体系如下：
申请码:申请号:CN201910529227.8 申请日:2019-06-19 公开号:CN110257430A 公开日:2019-09-20 国家:CN 国家/省市:94(深圳) 授权编号:授权时间:主分类号:C12N 15/867 专利分类号:C12N15/867;C12N15/65 范畴分类:18H; 申请人:中国农业科学院农业基因组研究所 第一申请人:中国农业科学院农业基因组研究所 申请人地址:518120 广东省深圳市大鹏新区鹏飞路7号中国农业科学院农业基因组研究所 发明人:张玉波;朱秀生;黄雷;李清 第一发明人:张玉波 当前权利人:中国农业科学院农业基因组研究所 代理人:汤东凤 代理机构:11350 代理机构编号:北京科亿知识产权代理事务所（普通合伙） 优先权:关键词:当前状态:审核中 类型名称:外观设计
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