论文摘要
多种鸟类会在漫长的飞行与迁徙中利用地磁场进行导航,鸽子是其中的典型代表,但包括鸽子在内的动物磁感应与磁导航机理尚无定论。基于隐花色素（Cry）的自由基对机理为动物磁感应行为指明了研究方向,该类蛋白的节律和光化学自由基反应是研究的重点。本文从鸽子隐花色素（ClCry）的序列发现与重定义出发,鉴定并完善了三种ClCry的全长序列,之后对它们的体内节律表达特性与基因性质进行了探索,同时采用原核、真核体系进行了表达和纯化,依此深入研究其光受体、磁受体性质。ClCry的基因序列已有初步报道,经分析比对,发现其序列不完整、命名欠妥等诸多问题。本文首先克隆出三种ClCly的全长序列,给出正确的注释,并规范了该类蛋白的分类标准。经组织分布和亚细胞定位实验,发现三种ClCry均广泛存在于各组织中,且均具备核定位能力,预示着其拥有调控机体节律的潜力。后续的qPCR实验则将不同ClCry的节律特性加以区分,为解答鸟类Cry是否具备节律功能的疑惑提供了确切的证据,并为中等进化动物Cry的基因功能提供了指导。Cry蛋白一般携带FAD辅基,这是光化学自由基反应的必需元件。然而,在不同表达系统所得的、不同物种和类别的Cry蛋白的FAD含量、状态呈现显著的不同,这也影响到了Cry光功能的进一步分析。本文通过对不同ClCry在不同表达系统的对比研究,提供了直接的实验结果证据,使这一问题得以解决。其中真核表达的ClCry4具有化学当量（>88%）的FAD辅基,但ClCry1却并未结合黄素辅基。基于此,我们进一步对ClCry4进行了光致还原的过程与机理分析,明确了其中FAD辅基的具体还原过程,并首次通过定点突变实验证实了保守的三色氨酸电子传递链在ClCry4中的体外光功能。同时,也分别确定了该蛋白两端结构域的光致构象变化特性。地磁导航是鸽子最具吸引力的特性,但磁性蛋白却一直未能获得公认的结果。本文的前一部分研究结果,基本否定了原以为的ClCry1的磁敏特性,却预示着新发现的ClCry4可能是合格的候选者。瞬态吸收分析证实,黄素-色氨酸模拟体系中存在长寿命的黄素中性自由基F1H·;随后的蛋白体外稳态荧光检测证实,ClCry4在地磁场量级上存在响应差异,首次证实了该蛋白的磁效应性质。
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摘要Abstract第一章 绪论 1.1 动物Cry的分类与节律功能 1.1.1 动物Cry的发现与节律功能 1.1.2 动物Cry的结构、同源性与分类 1.2 Cry的辅基与光受体功能 1.2.1 黄素辅基及其性质 1.2.2 动物Cry的光功能 1.3 动物Cry潜在的磁受体功能 1.3.1 自由基对磁感应机理 1.3.2 动物Cry潜在的磁受体功能 1.4 本文选题依据与研究内容第二章 鸽子隐花色素ClCry的基因性质 2.1 基因克隆 2.1.1 鸽子基因组搜索与序列比对 2.1.2 组织获取、RNA抽提与RT-PCR 2.1.3 ClCry全长基因的获取与聚类分析 2.2 ClCry的聚类分析与组织分布 2.2.1 ClCry的聚类分析 2.2.2 ClCry的组织分布 2.3 ClCry的昼夜节律性表达 2.3.1 动物饲养与组织获取 2.3.2 ClCry节律表达的结果 2.4 ClCry的核定位研究 2.4.1 基于C端GFP标签的核定位 2.4.2 基于N端GFP标签的核定位 2.5 小节与讨论 2.5.1 ClCry的聚类和功能 2.5.2 ClCry的分布与节律功能 2.5.3 ClCry的亚细胞定位第三章 基于大肠杆菌和杆状病毒体系的ClCry表达与纯化 3.1 使用大肠杆菌系统表达纯化鸽子隐花色素 3.1.1 载体构建 3.1.2 表达及纯化条件的探索 3.1.3 大肠杆菌表达ClCry4的保存、初步分析与定量 3.2 使用杆状病毒系统表达纯化ClCry 3.2.1 载体构建 3.2.2 昆虫细胞培养与杆状病毒的扩增 3.2.3 ClCry的表达、纯化与分析 3.3 本章总结与讨论 3.3.1 ClCry4具有黄素辅基 3.3.2 Type4Cry三色氨酸电子传递链上不同位点突变体稳定性与已知的动物Cry不同 3.3.3 不同标签在表达纯化使用中的差异第四章 ClCry的光受体性质 4.1 Cl Cry1与ClCry4 的光谱分析 4.1.1 ClCry1的吸收光谱 4.1.2 ClCry4-WT的吸收光谱和荧光光谱 4.1.3 ClCry4-WT的光致还原 4.2 ClCry4突变体的光谱分析 4.2.1 ClCry4-W395F的光致还原 4.2.2 ClCry4-W350F的光致还原 4.3 ClCry4的光致构象改变 4.3.1 ClCry4-WT的光致构象改变:光解酶同源域（PHR domain） 4.3.2 ClCry4-WT的光致构象改变:C末端（C terminus） 4.4 本章小节 4.4.1 Type2 Cry与 Type4 Cry中的FAD含量有极大差别 4.4.2 三色氨酸电子传递链在Type4 Cry光致还原中的重要功能 4.4.3 Type4 Cry具备光致构象改变的特性第五章 鸽子隐花色素ClCry4的磁效应 5.1 黄素—色氨酸光致还原反应 5.1.1 核黄素与色氨酸的结构与吸收光谱 5.1.2 核黄素的瞬态吸收光谱 5.1.3 核黄素—色氨酸光致还原反应 5.2 荧光法测试ClCry4的磁效应 5.2.1 FAD荧光量子产率的测定 5.2.2 稳态荧光法测定ClCry4的磁响应 5.3 鸽子及其他典型动物的磁感应讨论 5.3.1 动物磁感应行为与机理的研究方法 5.3.2 目前动物磁感应研究存在的问题 5.3.3 本章研究内容总结与展望致谢参考文献作者在学期间取得的学术成果
文章来源
类型: 博士论文
作者: 王雪峰
导师: 吴文健,王璟,Aziz Sancar
关键词: 鸽子隐花色素,黄素,光受体,磁受体,节律
来源: 国防科技大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 国防科技大学
分类号: Q811
DOI: 10.27052/d.cnki.gzjgu.2019.000126
总页数: 173
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标签：鸽子隐花色素论文; 黄素论文; 光受体论文; 磁受体论文; 节律论文;
