西瓜噬酸菌效应蛋白Ace0201和Ace1242的鉴定及生物学功能初步分析

论文摘要

西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）引起的瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch,BFB）是一种具有毁灭性的种传病害,主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物。该病害的发生流行可造成巨大的经济损失,严重制约了西瓜、甜瓜产业的健康发展。由于对该病菌的致病机理了解匮乏,目前尚缺乏行之有效的防控手段,解析西瓜噬酸菌的致病机制是解决病害防控问题的关键。众所周知,由三型分泌系统（Type III secretion system,T3SS）分泌的效应蛋白（Type 3 effectors,T3Es）在植物病原细菌的致病过程中发挥着关键作用,因此对效应蛋白的筛选鉴定及功能研究有助于深入理解病原菌的致病机理。然而目前针对西瓜噬酸菌效应蛋白的研究却鲜有报道,故本试验以西瓜噬酸菌Aac5为研究对象,利用生物信息学、烟草瞬时表达系统、Western blot、q RT-PCR等技术手段筛选鉴定西瓜噬酸菌的特异性效应蛋白以及与效应蛋白Avr Rpt2同源的假定效应蛋白,并对两者的生物学功能进行初步分析,结果如下:1.假定效应蛋白Ace0201的鉴定及生物学功能的初步分析生物信息学分析表明在西瓜噬酸菌中存在一个与效应蛋白Avr Rpt2同源的假定蛋白Ace0201。q RT-PCR结果表明西瓜噬酸菌T3SS核心基因hrp G及hrp X调控其编码基因ace0201的表达;Western blot检测结果进一步证实Ace0201具有分泌功能且受到T3SS的调控,说明Ace0201是一个三型效应蛋白。进一步研究发现Ace0201可以定位于烟草的细胞膜和细胞核,且具有抑制促细胞凋亡蛋白BAX诱导的细胞程序性死亡（Programmed cell death,PCD）及抑制活性氧（Reactive oxygen species,ROS）爆发的功能特征,基因ace0201缺失后西瓜噬酸菌对天然寄主西瓜的致病能力增强。2.西瓜噬酸菌特异性效应蛋白的筛选利用生物信息学软件对西瓜噬酸菌的效应蛋白进行预测分析,获得了31个候选特异性效应蛋白;利用烟草瞬时表达系统对候选特异性效应蛋白进行进一步筛选,结果成功获得一个能够抑制BAX诱导PCD反应的候选效应蛋白Ace1242,BLAST比对分析表明Ace1242与其他病原细菌的效应蛋白不具有同源性,这些结果说明Ace1242具备抑制植物免疫反应的功能特征,且可能为西瓜噬酸菌的特异性效应蛋白。3.候选效应蛋白Ace1242的鉴定及生物学功能的初步分析候选效应蛋白Ace1242包含95个氨基酸,研究发现西瓜噬酸菌T3SS核心基因hrp G及hrp X调控其编码基因ace1242的表达,说明Ace1242受到T3SS的调控;致病性试验结果表明,基因ace1242缺失后西瓜噬酸菌对天然寄主西瓜的致病能力显著下降,说明Ace1242在病原菌的致病过程中行使着一定的功能;亚细胞定位的观察结果表明Ace1242可以定位于烟草的细胞膜和细胞核;ROS的测定结果显示Ace1242显著抑制ROS的爆发,表明Ace1242可以抑制烟草的PTI反应。综上,本研究在西瓜噬酸菌中成功鉴定了一个与Avr Rpt2同源的效应蛋白Ace0201,并筛选鉴定到一个潜在的特异性效应蛋白Ace1242,这两个效应蛋白都在西瓜噬酸菌的致病过程中发挥着一定作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 瓜类细菌性果斑病及植物病原细菌T3Es的研究进展
•   1.1 瓜类细菌性果斑的研究进展
•     1.1.1 瓜类细菌性果斑病的发生及分布
•     1.1.2 瓜类细菌性果斑病的病原菌
•     1.1.3 西瓜噬酸菌致病机理的研究现状
•     1.1.4 瓜类细菌性果斑病的防治方法
•   1.2 植物病原细菌T3Es的研究进展
•     1.2.1 T3Es与植物免疫系统的互作机制
•     1.2.2 效应蛋白作用机制研究
•     1.2.3 效应蛋白的鉴定方法
•     1.2.4 西瓜噬酸菌中效应蛋白的研究进展
• 第二章 假定效应蛋白Ace0201 的鉴定及功能初步分析
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 供试菌株及质粒
•     2.1.2 引物序列
•     2.1.3 培养基及溶液
•     2.1.4 试剂
•     2.1.5 仪器及设备
•     2.1.6 植物材料
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 生物信息学对Avr Rpt2 同源蛋白的分析
•     2.2.2 自杀性重组载体的构建
•     2.2.3 目的基因缺失突变株的构建
•     2.2.4 瞬时表达载体及菌株的构建
•     2.2.5 假定效应蛋白与BAX共表达
•     2.2.6 目的基因转录水平表达量分析
•     2.2.7 Western blot对供试菌株分泌蛋白的检测方法
•     2.2.8 西瓜噬酸菌在寄主体内生长能力的测定
•     2.2.9 蛋白亚细胞定位试验
•     2.2.10 ROS测定试验
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 生物信息学分析结果
•     2.3.2 ace0201 突变体菌株的获得
•     2.3.3 Ace0201 抑制由BAX诱导的PCD
•     2.3.4 ace0201 在ΔhrpG及ΔhrpX菌株中的表达情况
•     2.3.5 Ace0201 蛋白分泌功能的鉴定结果
•     2.3.6 ace0201 对西瓜噬酸菌致病力的影响
•     2.3.7 Ace0201 在本氏烟中的定位情况
•     2.3.8 Ace0201 对本氏烟ROS爆发的影响
•   2.4 本章小结与讨论
• 第三章 西瓜噬酸菌特异性效应蛋白的筛选
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 供试菌株及质粒
•     3.1.2 引物序列
•     3.1.3 培养基及溶液
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 生物信息学预测西瓜噬酸菌的效应蛋白
•     3.2.2 瞬时表达载体及菌株的构建
•     3.2.3 候选效应蛋白与BAX共表达
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 西瓜噬酸菌效应蛋白的预测结果
•     3.3.2 瞬时表达载体及菌株的获得
•     3.3.3 Ace1242 抑制BAX诱导的PCD反应
•   3.4 本章小结与讨论
• 第四章 候选效应蛋白Ace1242 的鉴定及功能初步分析
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 供试菌株及质粒
•     4.1.2 引物序列
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 ace1242 突变体菌株的筛选
•     4.2.2 目的基因转录水平表达量分析
•     4.2.3 Western blot对供试菌株分泌蛋白的检测方法
•     4.2.4 西瓜噬酸菌在寄主体内生长能力的测定
•     4.2.5 蛋白亚细胞定位试验
•     4.2.6 ROS测定试验
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 ace1242 突变菌株的获得
•     4.3.2 ace1242 在ΔhrpG及ΔhrpX菌株中的表达情况
•     4.3.3 Ace1242 蛋白分泌功能的鉴定结果
•     4.3.4 ace1242 对西瓜噬酸菌致病力的影响
•     4.3.5 Ace1242 在本氏烟中的定位情况
•     4.3.6 Ace1242 对本氏烟ROS爆发的影响
•   4.4 本章小结与讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表文章

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨琳琳

导师: 赵廷昌

关键词: 西瓜噬酸菌,三型效应蛋白,筛选,鉴定,功能分析

来源: 沈阳农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 沈阳农业大学

分类号: S432.42

DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000340

总页数: 84

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