山羊痘病毒KLP2基因缺失的重组病毒的纯化及ANK基因缺失病毒的构建

论文摘要

山羊痘呈世界性流行,疫苗注射免疫是预防本病较为有效的方法。但是由于使用的是弱毒苗,使用过程中往往产生一些副作用,例如孕羊流产、毒力返强等。为了进一步降低疫苗毒性,本研究对以细胞重组法得到的缺失毒力因子KLP2的重组羊痘病毒疫苗株进行纯化,以获得更加安全的羊痘疫苗。同时为了研究山羊痘的另一毒力因子ANK的作用,构建了缺失该基因病毒的表达载体,为进一步研究更安全有效的羊痘疫苗提供了依据。首先无菌采取23月龄的健康小公羊睾丸和健康发育的胎羊,分别分离睾丸组织和胎羊皮肤组织,用剪碎组织和胰酶消化分散细胞法培养并获得生长良好的睾丸和胎羊皮肤原代细胞,并对其培养特性进行研究。细胞贴壁生长至80%90%时接种山羊痘病毒疫苗株,培养并观察其细胞病变。其次,提取KLP2缺失的转移载体质粒,用LipofectamineTMM 2000转染至山羊痘病毒感染的羊睾丸原代细胞,培养并定期显微镜下观察带绿色荧光的重组病毒。挑取带荧光细胞接种原代细胞用4种方法纯化重组病毒。并用荧光密度及PCR方法确定重组病毒是否纯化。再次,接种纯化的重组病毒于羊睾丸原代细胞,观察其生长速度、细胞病变程度等评价其效果,并以疫苗株和流行毒株做对照;以皮肤刮擦点种结合皮下注射的方式接种重组病毒于小鼠,同时以疫苗株和流行株做对照,观察小鼠临床变化,在动物水平评价重组病毒的效果。另外,采用融合PCR的方法,将ANK基因两侧同源臂连接在报告基因GFP两侧,并与pET42b载体连接得到ANK基因缺失的表达载体,将其转染至羊痘病毒疫苗株感染的羊睾丸原代细胞,镜检确定是否带绿色荧光的重组病毒。结果成功的制备了羔羊睾丸原代细胞和胎羊皮肤原代细胞,睾丸细胞培养特性较优,作为本研究后续实验所用细胞。KLP2基因缺失的重组病毒的纯化方法以第四种最为有效,传34代即可得到纯化病毒。重组病毒毒力效果与疫苗株和流行株相比,在细胞水平上有肉眼可见的减弱效果,在小鼠试验中没有明显的临床效果。本试验成功构建了ANK基因山羊痘病毒THX株GTPV-138和GTPV-141.2两个基因缺失的转移载体,并得到目的基因缺失的重组病毒。本研究得到了一种较快构建羊痘基因缺失重组病毒和带荧光标记病毒的纯化方法为后期羊痘病毒生物学特性研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表（Abbreviations）
• 第1章 引言
•   1.1 羊痘病原
•     1.1.1 羊痘病毒的理化特性
•     1.1.2 羊痘病毒的基因组结构
•     1.1.3 羊痘病毒的分离培养
•   1.2 羊痘的流行病学特征
•   1.3 羊痘的临床症状
•   1.4 羊痘的病理变化
•   1.5 羊痘的诊断与防制
•     1.5.1 羊痘的诊断
•     1.5.2 防制措施
•   1.6 羊痘的免疫及疫苗
•   1.7 重组山羊痘病毒的应用
•   1.8 羊痘病毒KLP2及ANK基因
•   1.9 研究目的和意义
• 第2章 羊源原代细胞制备及其特性研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料与试剂
•     2.1.2 方法
•   2.2 结果
•     2.2.1 正常细胞的培养结果
•     2.2.2 绵羊睾丸原代细胞和胎羊皮肤原代细胞复苏、传代的比较
•     2.2.3 细胞接毒培养结果
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第3章 山羊痘病毒毒力因子KLP2基因缺失病毒的重组及纯化
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 材料与试剂
•     3.1.2 方法
•   3.2 结果
•     3.2.1 重组病毒纯化
•     3.2.2 重组病毒纯化的PCR鉴定
•     3.2.3 重组病毒毒力效果评价
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第4章 山羊痘病毒THX株2个ANK基因缺失转移载体的构建
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料与试剂
•     4.1.2 方法
•   4.2 结果
•     4.2.1 分段PCR扩增目的基因
•     4.2.2 融合PCR扩增目的基因
•     4.2.3 菌液PCR检验结果
•     4.2.4 PCR检验质粒表达结果
•     4.2.5 重组病毒结果
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 米丽开姆·托合提尼亚孜

导师: 李有文,莫力尼牙孜·莫来克

关键词: 山羊痘病毒,基因,重组病毒,基因缺失

来源: 塔里木大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 塔里木大学

基金: 国家自然科学基金项目,“山羊痘病毒毒力因子KLP1互作蛋白筛选及生物学功能研究”的部分研究成果(项目编号:31360616),课题主持人:李有文教授(塔里木大学)

分类号: S852.65

总页数: 53

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