诱导IPEC-J2细胞自噬的猪流行性腹泻病毒非结构蛋白筛选

论文摘要

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）可以引起急性、高度接触性肠道传染病——猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）,近年来给我国养猪业造成了巨大的经济损失。各日龄猪均可感染PEDV,其中对哺乳仔猪的危害最为严重,死亡率可达90%100%。2010年末PEDV在我国南方地区开始流行,到2014年为止我国各地区猪场都可检出PEDV阳性。虽然国内灭活疫苗的使用在一定程度上抑制了PEDV的进一步扩散,但由于临床中不断有PEDV变异毒株的出现,传统疫苗的保护效果并不理想。PEDV仍是造成仔猪流行性急性腹泻的主要病原之一。细胞自噬（autophagy）是一种广泛存在于真核细胞中高度保守的溶酶体依赖性降解途径,对于维持细胞内环境稳态和清除损伤的细胞器至关重要。在外源性因素刺激下,自噬也可作为一种防御机制发挥作用。有研究表明自噬与癌症的发生、病原体感染等过程都具有密切的关系。许多病毒在感染宿主的过程中都可诱导细胞自噬的发生。为了探究PEDV CV777株感染IPEC-J2细胞诱导自噬的机制并筛选出参与诱导细胞自噬的PEDV关键非结构蛋白,我们展开了如下研究。首先将PEDV CV777株在IPEC-J2细胞中进行适应传代,利用透射电镜观察、Western blot检测和激光共聚焦免疫荧光等技术对PEDV是否诱导细胞自噬进行分析。结果显示PEDV感染后IPEC-J2细胞中自噬样双层膜囊泡结构增多,并诱导GFP-LC3在细胞内呈显著的点状聚集。Western blot结果表明自噬相关标志蛋白LC3-II和Beclin-1的表达明显上调,自噬底物标志蛋白p62则表现为降解趋势。说明PEDV侵染IPEC-J2细胞能诱导细胞完全自噬的发生。为了深入研究PEDV复制过程中各非结构蛋白对细胞自噬的影响,构建了PEDV各非结构蛋白的真核表达质粒,转染IPEC-J2细胞后检测各蛋白对细胞自噬的影响。结果显示PEDV非结构蛋白Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp8、Nsp10、Nsp14都可上调自噬相关基因LC3-II的表达,其中Nsp5和Nsp8引起的LC3-II的聚集效果极显著。我们选取Nsp5、Nsp6和Nsp8进行诱导细胞自噬的验证,在转染pCMV-Nsp5、pCMV-Nsp6和pCMV-Nsp8的基础上,以特异性小干扰RNA（siRNAs）对Nsp5、Nsp6和Nsp8的表达进行干扰。结果显示,siRNA使Nsp5、Nsp6和Nsp8失去诱导细胞自噬的能力。此外我们发现诱导细胞自噬可促进PEDV的增殖,而抑制细胞自噬则不利于PEDV的增殖。这说明细胞自噬与PEDV的增殖也有着密切的关系。本研究证明PEDV可诱导IPEC-J2细胞自噬,而细胞自噬有利于PEDV自身的增殖,并筛选出诱导细胞自噬效果显著的关键PEDV非结构蛋白Nsp5和Nsp8。本研究对于进一步探索PEDV非结构蛋白诱导细胞自噬的机制提供了理论依据和物质基础。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 猪流行性腹泻概述
•   1.2 PEDV病原学特征
•     1.2.1 PEDV分类及理化性质
•     1.2.2 PEDV培养特性
•   1.3 PEDV基因组结构特征
•     1.3.1 PEDV非编码区的生物学功能
•     1.3.2 PEDV非结构蛋白
•     1.3.3 PEDV结构蛋白和附属蛋白
•   1.4 细胞自噬
•     1.4.1 细胞自噬的分类
•     1.4.2 细胞自噬的过程
•     1.4.3 冠状病毒与细胞自噬
•   1.5 研究目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 细胞、病毒、菌株和质粒
•     2.1.2 主要试剂、工具酶和抗体
•     2.1.3 实验试剂的配制
•     2.1.4 实验仪器
•     2.1.5 引物设计
•     2.1.6 siRNA的合成
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 PEDV在 IPEC-J2 细胞中传代培养及RT-PCR鉴定
•     2.2.2 PEDV在 IPEC-J2 细胞中的病毒滴度和生长曲线测定
•     2.2.3 间接免疫荧光（IFA）实验
•     2.2.4 激光共聚焦显微镜观察
•     2.2.5 透射电镜观察
•     2.2.6 PEDV各非结构蛋白基因真核重组表达质粒的构建
•     2.2.7 连接产物的转化及真核表达质粒鉴定
•     2.2.8 PEDV各非结构蛋白基因质粒提取
•     2.2.9 PEDV各非结构蛋白基因质粒和siRNA转染
•     2.2.10 Western blot检测蛋白表达水平
•     2.2.11 数据统计
• 3 结果
•   3.1 PEDV在 IPEC-J2 细胞中的传代培养
•     3.1.1 PEDV在 IPEC-J2 细胞中传代培养及RT-PCR鉴定
•     3.1.2 病毒生长曲线的测定
•     3.1.3 间接免疫荧光检测PEDV感染IPEC-J2 细胞
•   3.2 PEDV感染诱导IPEC-J2 细胞自噬
•     3.2.1 透射电镜观察PEDV诱导的自噬体的形成
•     3.2.2 激光共聚焦技术检测PEDV感染对GFP-LC3 的影响
•     3.2.3 Western blot检测PEDV诱导LC3-II的表达
•   3.3 PEDV诱导完整细胞自噬流的发生
•   3.4 PEDV感染对自噬相关因子的影响
•   3.5 PEDV各非结构蛋白基因真核表达质粒的构建与鉴定
•     3.5.1 PEDV各非结构蛋白基因的真核表达载体构建
•     3.5.2 PEDV各非结构蛋白基因的真核表达载体鉴定
•   3.6 诱导细胞自噬的PEDV非结构蛋白的筛选
•   3.7 细胞自噬对病毒增殖的影响
• 4 讨论
•   4.1 PEDV的体外培养
•   4.2 细胞自噬的调控
•   4.3 PEDV与细胞自噬的关系
•   4.4 细胞自噬与病毒复制的关系
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘海鑫

导师: 李广兴

关键词: 猪流行性腹泻病毒,细胞,非结构蛋白,自噬,病毒增殖

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

分类号: S852.651

总页数: 77

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