家蚕杆状病毒表达的鸡干扰素的应用和该病毒用于A型血友病基因治疗的研究

论文摘要

杆状病毒作为一种具有高效表达能力的分子生物学工具,在昆虫细胞及虫体中用于重组蛋白质的生产已有超过三十年的历史,并且相关技术仍然在持续改进。此外,杆状病毒还可作为基因呈递载体,用于将外源基因呈递至哺乳动物细胞及体内。由于哺乳动物体内没有任何病毒复制或其他潜在风险,杆状病毒作为基因呈递载体也越来越受到重视。本文利用实验室构建的禽类干扰素杆状病毒生产平台,成功表达了高活性鸡α（chIFN-α）、γ（chIFN-γ）以及λ（chIFN-λ3）干扰素,并使用鸡成纤维细胞（CEF）对各类鸡干扰素在抗禽类疾病,如新城疫（ND）的实际应用效果进行了验证,发现在各类干扰素组合中chIFN-γ抗NDV的效果最好。通过利用转录组测序技术对试验样品的分析发现,干扰素处理后细胞中多种干扰素诱导基因（ISGs）及参与抗原呈递的各类基因都呈显著上调表达,同时细胞自身也开始分泌chIFN-γ,这为chIFN-γ抗NDV的良好效果提供了分子水平的解释,也为chIFN-γ作为新型抗病毒药物及疫苗佐剂的应用提供了理论依据。同时根据预实验及相关文献报道,进一步应用家蚕杆状病毒表达平台所获得的chIFN-α及chIFN-γ对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的互作效应进行了研究,并尝试在AA肉鸡生产实践过程中的使用方式及作用进行了试验探究,试验结果显示试验组肉鸡的体重相较对照组出现了高于4%的体重增长。在对细胞及动物试验样品的转录组学测序数据进行分析后,我们发现CEF试验中,大量的ISGs出现了上调表达,证明了干扰素的抗病毒活性。而在试验动物脂肪组织中发现了大量与肌肉生长发育相关的基因显著上调表达,同时肝脏中出现了ISGs的不同程度上调表达,这为试验中发现的动物体重增长现象提供了理论解释。我们也对杆状病毒作为一种潜在的优秀基因呈递病毒载体的应用进行了试验,选取人凝血因子Ⅷ（FⅧ）全长基因作为呈递对象,在人肾上皮细胞系HEK293T进行了该基因呈递可行性的初步研究。我们还利用A型血友病模型小鼠,通过口服及腹腔注射等手段,对家蚕杆状病毒作为基因呈递载体的呈递效果和可行的给药途径进行了检测,并对包括CMV、CAG、HLP在内的不同启动子在向基因缺陷小鼠体内呈递FⅧ时的效率进行比较分析。其中HLP的呈递的凝血因子Ⅷ达到了正常健康人水平的17%,足以达到治疗水平,并且在多轮试验后小鼠体内并未产生针对凝血因子Ⅷ的中和抗体,为长期治疗提供了可能。本文利用家蚕杆状病毒表达系统表达的鸡干扰素在禽类抗病及促生长功能的分子机理及应用前景进行了研究,并对口服给药的可能性进行了尝试,获得了较好的试验结果,为鸡干扰素在生产中的应用提供了有力的试验证据。同时我们首次利用家蚕杆状病毒进行了全长人凝血因子Ⅷ基因的基因呈递试验,并在动物试验阶段获得了成功,口服给药和腹腔注射给药就能达到治疗水平,为A型血友病的治疗提供了安全、高效、廉价的新方法。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
•   1.1 禽类干扰素的研究进展
•     1.1.1 干扰素的分类
•     1.1.2 禽类Ⅰ型干扰素
•     1.1.3 禽类Ⅱ型干扰素
•     1.1.4 禽类Ⅲ型干扰素
•     1.1.5 禽类干扰素抗病毒的分子机制
•   1.2 新城疫病毒
•     1.2.1 新城疫病毒
•     1.2.2 新城疫病毒对Ⅰ型干扰素的抑制作用
•   1.3 血友病及其治疗
•     1.3.1 血友病现状
•     1.3.2 血友病的治疗
•   1.4 杆状病毒与基因治疗
•     1.4.1 基因治疗
•     1.4.2 基因治疗使用的主要病毒载体
•     1.4.3 杆状病毒在基因治疗中的应用前景
•   1.5 本研究的目的及意义
•     1.5.1 研究目的
•     1.5.2 研究意义
• 第二章 鸡干扰素在CEF中抗NDV的分子机制探讨
•   2.1 材料及方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验方法
•   2.2 实验结果
•     2.2.1 不同组合鸡干扰素对NDV的抑制
•     2.2.2 不同试验组CEF的 Illumina RNA-Seq
•     2.2.3 在干扰素抗NDV试验中不同组组别之间的差异表达基因
•     2.2.4 差异基因的GO富集和KEGG富集分析
•     2.2.5 在差异基因中相关抗病毒基因的蛋白互作网络
•     2.2.6 ch IFN-γ+NDV组与NDV组之间的比较分析
•     2.2.7 主要差异表达基因的qPCR验证
•   2.3 本章讨论
•     2.3.1 不同干扰素在CEF中对NDV抗性的差异
•     2.3.2 ch IFN-γ在 CEF中抗NDV的可能分子机制的探究
• 第三章 复合表达鸡干扰素的抗病毒活性及对肉鸡生长影响的分子机制探讨
•   3.1 材料及方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验方法
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 AA肉鸡口服ch IFN-γ吸收情况检测
•     3.2.2 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素对AA肉鸡的体重及采食量的影响
•     3.2.3 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素处理CEF组与对照组之间的差异表达基因分析
•     3.2.4 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素AA肉鸡注射组与对照组之间的差异表达基因分析
•     3.2.5 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素AA肉鸡口服组与对照组之间的差异表达基因分析
•     3.2.6 CEF组的差异基因GO富集和KEGG富集分析
•     3.2.7 AA肉鸡口服组及注射组差异基因GO富集与KEGG富集分析
•     3.2.8 主要差异表达基因的qPCR验证
•   3.3 本章讨论
•     3.3.1 干扰素在CEF及AA肉鸡中显示出的抗病毒活性分析
•     3.3.2 AA肉鸡在使用干扰素后体重及进食量变化的可能原因分析
• 第四章 家蚕杆状病毒在A型血友病基因治疗中的应用
•   4.1 材料及方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验方法
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 基因呈递用重组杆状病质量检测
•     4.2.2 重组杆状病毒向HEK293T人肾上皮细胞系中呈递FⅧ
•     4.2.3 重组杆状病毒向基因敲除小鼠体内呈递FⅧ
•     4.2.4 小鼠血清中FⅧ抑制因子（中和抗体）检测
•   4.3 本章讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录A 小鼠基因型鉴定
• 附录B 试验中所用引物
• 附录C 试验中使用的 FⅧ序列
• 附录D 抗NDV试验 DEGs
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 杨鑫

导师: 张志芳

关键词: 鸡干扰素,家蚕杆状病毒表达系统,基因治疗,型血友病

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发计划课题,新发与再现畜禽重大疫病的致病与免疫机制研究(2016YFD0500108),鸡重要疫病免疫防控新技术研究(2017YFD0500706),国家自然基金(NSFC,GrantNo.31670156,31872430)

分类号: S852.65

DOI: 10.27630/d.cnki.gznky.2019.000042

总页数: 133

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