增强谷氨酸棒杆菌中底物供应及ido表达提高4-羟基异亮氨酸产量

论文摘要

4-羟基异亮氨酸（4-HIL）是一种极具潜力的糖尿病治疗药物。L-异亮氨酸双加氧酶（IDO）催化L-异亮氨酸（Ile）的C-4位发生羟基化形成4-HIL,同时α-酮戊二酸（α-KG）发生氧化并消耗氧气。在实验室前期研究中,将ido基因导入Ile生产菌Corynebacterium.glutamicum ssp.lactofermentum SN01中表达,实现了4-HIL的从头合成。本课题在ido表达菌株SN02的基础上,通过协同改善多底物的供应并提高IDO的活性,来提高4-HIL的产量。主要研究内容如下:（1）为了增强α-KG供应,分别表达异柠檬酸脱氢酶基因icd和敲除乙醛酸途径第一个基因aceA,获得菌株SZ08和SZ02。SZ08生长速率明显降低,4-HIL产量也下降,而SZ02中α-KG供应得到有效增强,4-HIL产量提高至69.47±2.18 mM,比出发菌株SN02的产量高18.9%,同时Ile合成得到加强,4-HIL与Ile的总量提高39.7%。（2）为了加强Ile供应,在aceA敲除菌中分别共表达ido-mqo和ido-lysC。所得菌株SZ03和SZ09的Ile浓度提高,4-HIL与Ile的总量增加,但Ile向4-HIL的转化率降低,使得4-HIL产量下降,原因可能是IDO活性不足。（3）为了提高IDO活性,将来自Bacillus weihenstephanensis的Ido基因ido3与mqo和ido共表达,构建菌株SZ04。共表达ido3有效地提高了IDO活性,使SZ04中4-HIL产量提高至91.54±8.29 mM。将ido3与lysC和ido共表达,构建菌株SZ10,4-HIL产量提高至78.38±1.63 mM。因此,ido3与mqo和ido共表达更有利于4-HIL的合成。（4）为了提高细胞的摄氧速率,在SZ04基础上再分别表达vgb和PdnaK启动子、PclgR启动子控制的vgb,获得菌株SZ05、SZ06和SZ07。虽然vgb的表达未对4-HIL产量产生显著影响,但加快了发酵前72 h中的细胞生长速度和4-HIL合成速率,尤其是用PdnaK启动子表达vgb时。发酵72 h时,在PdnaK-vgb表达菌株SZ06中4-HIL的产量是SZ04的2倍。（5）为了进一步提高4-HIL的产量,在优化的发酵培养基中培养vgb表达菌株SZ05、SZ06和SZ07。三株菌的4-HIL产量增加至102-117 mM,Ile向4-HIL的转化率都达到98%以上,其中SZ05的4-HIL产量增加至117.31±0.16 mM（17.24±0.02 g/L）,比出发菌株SN02的产量提高了1.0倍,糖酸转化率提高至0.166 mol/mol,比SN02提高80%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 4 -羟基异亮氨酸简介
•     1.1.1 4 -羟基异亮氨酸的来源与结构
•     1.1.2 4 -羟基异亮氨酸的功能
•   1.2 4 -羟基异亮氨酸的制备方法
•     1.2.1 种子提取法
•     1.2.2 化学合成法
•     1.2.3 生物酶催化法
•     1.2.4 微生物发酵法
•   1.3 重组谷氨酸棒杆菌中4-羟基异亮氨酸的合成途径及底物供应
•     1.3.1 4 -羟基异亮氨酸的合成途径
•     1.3.2 L-异亮氨酸的合成途径
•     1.3.3 α-酮戊二酸的合成途径
•     1.3.4 氧气的供应
•   1.4 异亮氨酸双加氧酶概况
•   1.5 立题背景与意义
•   1.6 主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 主要引物
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 实验试剂
•     2.1.5 培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 分子生物学实验操作
•     2.2.2 aceA敲除菌的构建
•     2.2.3 表达质粒和相关菌株的构建
•     2.2.4 重组谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵条件
•     2.2.5 发酵参数的测定
•     2.2.6 氨基酸和有机酸的测定
•     2.2.7 IDO酶活的测定
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 增强α-KG供应的作用
•     3.1.1 过表达icd对4-HIL发酵的影响
•     3.1.2 敲除aceA对4-HIL生产的影响
•   3.2 过表达mqo或 lysC提高Ile供应的作用
•     3.2.1 过表达菌株的构建
•     3.2.2 过表达mqo或 lysC对菌株生长的影响
•     3.2.3 过表达mqo或 lysC对4-HIL产量的影响
•   3.3 共表达ido3 提高IDO酶活的作用
•     3.3.1 ido3 单表达菌株的4-HIL产量
•     3.3.2 ido和ido3 共表达菌株的IDO酶活和4-HIL产量
•   3.4 共表达vgb增强氧气供应的作用
•     3.4.1 vgb共表达菌株的构建
•     3.4.2 表达vgb对菌株生长的影响
•     3.4.3 表达vgb对4-HIL产量的影响
•   3.5 优化发酵培养基对4-HIL发酵的影响
•     3.5.1 优化发酵培养基对菌株生长及耗糖的影响
•     3.5.2 优化发酵培养基对4-HIL生产的影响
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张舒萍

导师: 史锋

关键词: 羟基异亮氨酸,谷氨酸棒杆菌,底物供应

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,有机化工,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ922;TQ464.7

总页数: 57

文件大小: 4885K

下载量: 42