洛阳栾川喀斯特洞穴细菌资源多样性及其抗菌活性菌株筛选

论文摘要

洞穴是岩石受到侵蚀或火山岩浆冷却形成的地下空间或通道,环境黑暗潮湿,营养物质匮乏,是陆地上极端环境的一种,洞穴中蕴藏着大量的微生物资源。本文基于纯培养和免培养的方法对洛阳鸡冠洞（JGD）和其邻近的一处无名洞（WMD）洞穴的细菌多样性进行初步探索,旨在揭示洞穴环境细菌资源多样性及群落组成;同时,利用多相分类的方法对2株潜在新物种进行鉴定,明确它们的分类地位;最后,对分离到的菌株进行抗菌活性筛选,期望得到对水产动物致病菌有抑制作用的活性菌株。利用Illumina高通量测序技术对JGD和WMD的14个环境样品进行16S rRNA基因V4区域测序分析,共得到224,109条原始序列,注释到1,800个OTU,平均长度为294 bp,隶属于36个门,89个纲,123个目,136个科,172个属。其中占优势的细菌门类主要是变形菌门（Proteobacteria,37.3%）和放线菌门（Actinobacteria,18.7%）。其次是绿弯菌门（Chloroflexi,8.2%）、酸杆菌门（Acidobacteria,7.1%）、拟杆菌门（Bacteroidetes,5.7%）（Planctomycetes,5.6%）。采用10种分离培养基、2个分离温度对两个洞穴环境中的可培养微生物进行分离,共分离获得1,071株菌,经过去重复以及16S rRNA基因测序之后,得到676株菌的分类信息,分属于放线菌门、变形菌门、厚壁菌门（Firmicutes）和异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）的8个纲,20个目,35个科,70个属。其中放线菌门的微生物在洞穴中分布最多,共有530株菌属于放线菌门,其中属水平上丰度较高的是类诺卡氏菌属（Nocardioides,30.75%）和链霉菌属（Streptomyces,16.98%）;其次,有 1 1 1个菌株属于厚壁菌门,35株菌属于变形菌门。JGD和WMD的细菌群落结构有一些差异,在JGD中占优势的微生物类群依次是类诺卡氏菌属、链霉菌属、微杆菌属（Microbacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、诺卡氏菌属（Nocardia）;在WMD中,优势类群依次是芽孢杆菌属（Bacillus）、红球菌属（Rhodococcus）、节杆菌属（Arobacter）、链霉菌属。不同分离温度下,JGD细菌多样性呈现明显差异:当分离温度为28℃时,得到的菌株分布在37个属,分离温度为15℃时,仅得到33个属,且在28℃时得到的物种丰富度较15℃时高。利用多相分类方法对分离到的潜在新分类单元CFH 30183T、CFH 30205T进行鉴定,确定了它们的分类地位,其拉丁名分别为Ornithinimicrobium cavernae sp.nov.,Nocardioides allogilvus sp.nov.。为了筛选到对致病菌有抑制作用的抗性菌株,从分离到的菌株中选取49株进行抗菌活性检测,选用RA、ISP 2、AM3三种培养基进行发酵培养,8株致病菌作为指示菌。结果表明:29株受测菌（占59.2%）对6种以上的指示菌都有抑制作用,且对副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的抑菌效果最好;在获取的147种发酵产物中,有133种发酵产物对嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）有抑制作用,占90.5%,129种发酵产物对副溶血弧菌有抑制作用,占87.8%,116种发酵产物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Stphylococcius aureus 有抑制作用,占 78.9%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 水产病害及防控现状
•   1.2 特殊生境的微生物研究现状
•     1.2.1 特殊生境的的定义及类型
•     1.2.2 特殊生境微生物资源的多样性
•     1.2.3 特殊生境微生物资源的应用
•   1.3 洞穴环境的微生物研究现状
•     1.3.1 洞穴的类型及分布
•     1.3.2 洞穴微生物资源的多样性
•     1.3.3 洞穴微生物资源的应用
•   1.4 环境微生物多样性研究技术
•     1.4.1 传统纯培养技术及其应用
•     1.4.2 高通量测序技术在微生物多样性研究中的应用
•   1.5 研究意义及创新点
•     1.5.1 研究内容及意义
•     1.5.2 本研究的创新点
• 第二章 基于高通量测序的洞穴微生物群落结构及多样性研究
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 采样地点及样品采集
•     2.1.2 样品的总DNA提取
•     2.1.3 16SrRNA基因扩增及测序
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 稀释性曲线（rarefaction curve）分析
•     2.2.2 α-多样性指数（Alpha-diversityindex）
•     2.2.3 β-多样性分析
•     2.2.4 分类学分析
•   2.3 讨论
•   2.4 本章小结
• 第三章 鸡冠洞及无名洞可培养微生物多样性研究
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 样品采集及信息
•     3.1.2 培养基设计及配方
•     3.1.3 样品处理和分离
•     3.1.4 菌株分类地位的初步确定
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 洞穴可培养微生物多样性分析
•     3.2.2 不同分离温度、不同洞穴之间的微生物多样性比较分析
•     3.2.3 不同分离培养基的微生物多样性比较分析
•   3.3 讨论
•   3.4 本章小结
• 第四章 潜在新分类单元的多相分类鉴定
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 菌株形态的透射电镜观察
•     4.1.3 生理生化特征实验
•     4.1.4 化学分类实验
•     4.1.5 分子分类学实验
•   4.2 结果和分析
• T分类地位的确定'>    4.2.1 菌株CFH 30183^T分类地位的确定
• T分类地位的确定'>    4.2.2 菌株CFH 30205^T分类地位的确定
•   4.3 讨论
•   4.4 本章小结
• 第五章 洞穴环境微生物抗菌活性研究
•   5.1 材料和方法
•     5.1.1 测试菌株及指示菌株
•     5.1.2 菌株发酵
•     5.1.3 菌株发酵液的萃取及抗菌活性检测
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 菌株对不同指示菌的抑制效果分析
•     5.2.2 不同培养基的发酵液的抑菌情况分析
•   5.3 讨论
•   5.4 本章小结
• 全文总结及展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间学术业绩

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张玲玉

导师: 李文均,聂国兴

关键词: 特殊生境,岩溶洞穴,细菌多样性,抗菌活性

来源: 河南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河南师范大学

分类号: Q939.9

DOI: 10.27118/d.cnki.ghesu.2019.000519

总页数: 88

文件大小: 6078K

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