长链非编码RNAgm5532在破骨细胞分化过程的作用与机制研究

论文摘要

目的:破骨细胞起源于骨髓造血系统的单核/巨噬细胞系,其通过发挥骨吸收作用以维持骨重塑的平衡,使骨骼系统得到持续的更新。一旦破骨细胞的功能失调将会引起多种骨代谢性疾病,如骨质疏松,骨骼石化症等等。近期大量研究报道,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）可以通过调控多种细胞生理活动而影响细胞命运,包括增殖、分化、凋亡。然而lncRNA对破骨细胞分化影响的研究尚不够深入。因此,研究破骨细胞分化过程中lncRNA的调节功能及其相关分子机制,将会为骨代谢疾病治疗提供理论依据,并揭示潜在治疗靶点。方法:（1）利用微矩阵描绘出破骨细胞分化过程中表达量发生差异变化的lncRNA和mRNA,进行聚类分析、GO分析和Pathway分析,判定差异基因主要影响的生物学功能或者信号通路。（2）通过生物信息学方法对lncRNA进行筛选,建立小鼠骨髓单核巨噬细胞诱导破骨细胞模型,用实时荧光定量PCR（qPCR）技术对差异变化lncRNA进行验证。（3）用siRNA干扰技术敲低骨髓单核巨噬细胞长链非编码RNAgm5532（lncgm5532）,抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测对破骨细胞形成能力的影响;qPCR技术检测对破骨细胞分化相关mRNA的影响;酶活性检测对抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响;免疫荧光技术检测对破骨细胞骨架蛋白的影响;骨吸收馅窝实验检测对破骨细胞骨吸收功能的影响;CCK8实验检测对破骨细胞前体细胞活力的影响;Western Blotting方法检测对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路相关蛋白表达量的影响。（4）X射线照射骨髓单核巨噬细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测对破骨细胞形成的影响,qPCR检测lncRNA的表达水平。结果:首先,通过微矩阵分析发现lncgm5532在破骨细胞分化过程中显著上调,进一步通过qPCR得到了验证。其次,敲低lncgm5532后,一方面,破骨细胞的分化和骨吸收均受到抑制,破骨细胞分化相关基因的表达水平和抗酒石酸酸性磷酸酶活性下降,破骨细胞肌动蛋白环的结构受到损伤。另一方面,破骨细胞的增殖也同样受到抑制,同时AKT和ERK的蛋白表达水平下降。最后,诱导分化的破骨细胞中XPR1的表达水平显著身高,而siRNA敲低lncgm5532后,XPR1 mRNA的表达随之下降。并且X射线辐照后虽然不影响破骨细胞的数量,但是破骨细胞的大小明显增加,lncgm5532的表达也出现上调。结论:lncgm5532下调抑制破骨细胞的形成、骨吸收功能以及分化相关基因mRNA表达。lncgm5532下调抑制破骨细胞前体的细胞活力、破坏破骨细胞骨架结构。lncgm5532下调抑制MAPK相关信号通路蛋白表达、抑制XPR1的mRNA水平。X射线辐照能够促进破骨细胞的分化,增加lncgm5532的表达。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 RAW264.7细胞RANKL处理后lncRNA和mRNA表达谱变化
•   1. 材料与方法
•     1.1. 设备与仪器
•     1.2. 主要试剂与试剂配制方案
•     1.3. 实验方法
•     1.4. 统计学处理
•   2. 实验结果
•     2.1. 用于基因芯片分析的RNA样品的抽提和质控
•     2.2. 破骨细胞诱导分化前后差异表达的lncRNA和mRNA
•     2.3. 破骨细胞诱导分化后表达上调的mRNA
•     2.4. 破骨细胞诱导分化后表达下调的mRNA
•     2.5. 破骨细胞诱导分化后上调基因mRNA GO分析
•     2.6. 破骨细胞诱导分化后下调mRNA Go分析
•     2.7. 破骨细胞诱导分化后上调mRNA Pathway分析
•     2.8. 破骨细胞诱导分化后下调mRNA Pathway分析
•   3. 讨论
• 第二部分 长链非编码RNAgm5532对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
•   1. 材料与方法
•     1.1. 设备和器材
•     1.2. 主要试剂与试剂配制方案
•     1.3. 实验方法
•     1.4. 统计学方法
•   2. 实验结果
•     2.1. BMMs诱导分化破骨细胞
•     2.2. RANKL诱导的破骨细胞分化过程上调lncRNA分析
•     2.3. BMMs分化为破骨细胞过程中lncgm5532表达升高
•     2.4. lncgm5532下调抑制破骨细胞形成
•     2.5. lncgm5532下调抑制破骨细胞特异性酶TRAP的活性
•     2.6. lncgm5532下调影响破骨细胞分化相关基因的的mRNA表达
•     2.7. lncgm5532下调抑制破骨细胞骨吸收功能
•     2.8. lncgm5532下调影响破骨细胞骨架结构
•     2.9. lncgm5532下调影响破骨前体细胞细胞活力
•     2.10. lncgm5532影响MAPK通路相关蛋白表达
•     2.11. lncgm5532下调抑制XPR1 mRNA水平
•   3. 讨论
• 第三部分 X射线辐照对破骨细胞分化的影响
•   1. 材料与方法
•     1.1. 设备与仪器
•     1.2. 主要试剂与试剂配制方案
•     1.3. 实验方法
•     1.4. 统计方法
•   2. 实验结果
•     2.1. X射线辐照促进破骨细胞的融合
•     2.2. X射线辐照促进lncgm5532的表达
•   3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 研究生期间科研经历及发表文章
• 中英文缩略语对照表
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王子阳

导师: 周光明

关键词: 长链非编码,破骨细胞,放射性骨损伤,丝裂原活化蛋白激酶

来源: 苏州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 苏州大学

分类号: R329.2

DOI: 10.27351/d.cnki.gszhu.2019.002979

总页数: 75

文件大小: 5157K

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