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茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶在革兰氏阳性菌中的表达研究

2020-12-02阅读(397)

茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶在革兰氏阳性菌中的表达研究

论文摘要

谷氨酰胺转氨酶（EC 2.3.2.13,transglutaminase,TG）是一种催化肽或蛋白质伯胺之间的γ-羧酰胺基团与酰胺基团发生酰基转移反应的酶。蛋白质或多肽经谷氨酰胺转氨酶催化交联后稳定性较高,对蛋白酶降解和化学损伤具有更高的抵抗力,因此,它们被广泛应用于食品、药物、纺织、材料等各个工程领域。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶（MTG）由于底物催化范围广泛、酶活不依赖Ca2+存在等优点,成为目前的研究重点,但存在生产成本高、纯化过程复杂的问题。本文以茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）来源的mtg为研究对象,为了提高MTG的产量和酶活,分别在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中构建MTG组成型和诱导型重组表达载体,分别对MTG的异源表达时间、诱导时间和诱导剂浓度进行优化,得到高产量重组B.subtilis菌株和重组L.lactis菌株;通过酶原激活和Ni柱纯化,得到高酶活性的MTG,相比于商品MTG,酶原激活后的MTG催化交联大豆分离蛋白的能力更强。主要实验结果如下:（1）提取S.mobaraensi 基因组DNA,将其作为模板,扩增mtg基因,再与异源信号肽SPwapA/amyQ融合,将融合片段SPwapA/amyQ-mtg分别与组成型（pMA5）和诱导型（pHT43）表达载体连接,在大肠杆菌（Escherichia coli）中构建重组质粒pMA5mtg与pHT43mtg,并转化到B.subtili 中进行MTG的异源分泌表达。SDS-PAGE蛋白电泳显示,信号肽SPwapA可以指导MTG在B.subtilis中进行分泌表达,野生型B.subtilis 168分泌产生的MTG相比于六种蛋白酶缺失型B.subtilis WB600略高,但无明显差异,说明MTG可能不会被B.subtilis.中六种内源性细胞外蛋白酶/肽酶所降解,当表达时间在48 h时,重组B.subtil.168获得最高产量的MTG;信号肽SPamyQ可以指导MTG在B.subtilis 168中进行分泌表达,在终浓度为80μM IPTG诱导下表达12 h时,获得最高产量的MTG。发酵液经酶原激活和Ni柱纯化后,测得SPwapA指导分泌产生63.0±0.6 mg/L MTG,酶比活力为27.0±0.4 U/mg;SPamyQ指导分泌产生54.1 ±0.3 mg/L MTG,酶比活力为29.6±0.9 U/mg。与SPwapA相比,SPamyQ从枯草芽孢杆菌中指导分泌的S.moaraensis MTG较低,这可能是由于B.subtilis的天然信号肽因亲缘性较高而具有更好的外源蛋白运输能力,或者是因为通过Sec途径指导分泌的MTG不如该蛋白质的Tat途径有效。将酶原活化后所得成熟MTG应用到大豆分离蛋白交联反应中,发现MTG可有效催化大豆分离蛋白形成交联,且其催化效果相比于商品MTG较高。（2）提取A.Nmobaraenisis基因组DNA,将其作为模板,扩增mtg基因,再与异源信号肽SPusp45融合,将融合片段SPusp45-mtg分别与组成型（pNZ8048-p5）和诱导型（pNZ8048）表达载体连接,分别构建了由组成型启动子（Pp5）和诱导型启动子（PnisA）启动转录的MTG重组表达载体pNZ8048-Pp5-SPusp45（K2A）-promtg和pNZ8048-SPusp45-promtg,分别在L.lactis中进行异源分泌表达。SDS-PAGE蛋白电泳显示,在组成型启动子Pp5控制下,信号肽SPusp45（K2A）可以指导MTG在L.lacti 中进行分泌表达,当表达时间为12 h时,获得最高产量的MTG;在诱导型启动子PnisA控制下,信号肽SPusp45可以指导MTG在L.lactis中进行分泌表达,在终浓度为5 ng/mL的Nisin诱导下表达48 h时,获得最高产量的MTG。发酵液经酶原激活和Ni柱纯化后,测得SPusp45（K2A）指导分泌产生70.5±0.4 mg/L MTG,酶比活力为30.6±0.5U/mg;SPusp45指导分泌产生65.2±0.5mg/LMTG,酶比活力为29.4±0.3U/mg。SPusp45（K2A）与SPusp45指导分泌MTG的量无明显差别,说明由于Ncol限制性位点的引入导致信号肽SPusp45的2位赖氨酸突变为丙氨酸对L.lactis中异源MTG的分泌没有影响。将酶原活化后所得成熟MTG应用到大豆分离蛋白交联反应中,发现MTG可有效催化大豆分离蛋白形成交联,且其催化效果相比于商品MTG较高。（3）对MTG重组表达菌株L.lactis(pNZ8048-SPusp45-promtg 进行优化,将mature mtg克隆到L.lactis（pNZ8048-SPusp45-promtg）中,企图改善重组菌株L.lactis的生长,从而提高异源 pro-MTG-6iis的分泌表达。测定 L.lactis（pNZ8048-SPusp45-promtg-Nmature-mtg）与L.lactis（pNZ8048-SPusp45-promtg）重组菌株的生长曲线,曲线绘制结果显示,L.lactis（pNZ8048-SPusp45-promtg-mature-mtg）菌株在指数生长期具有较快的增长速率,达到稳定期后,菌株OD600稳定在3.2左右,说明mature MTG的存在改善了L.lactis重组菌株的生长。相同诱导条件下,L.lactis（pNZ8048-SPusp45-promtg-mature-mtg）分泌产生的Pr-MTG-6His 比 L.lactis（pNZ8048-SPusp45-promtg）多,说明mature MTG的存在可能促进了L.lactis菌株的生长,从而加快了细胞物质合成,提高了异源pro-MTG-6His的分泌表达。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 谷氨酰胺转氨酶的概述
  •     1.1.1 谷氨酰胺转氨酶的来源与分类
  •     1.1.2 MTG催化作用机理
  •     1.1.3 MTG的结构
  •   1.2 MTG的修饰功能
  •     1.2.1 溶解度
  •     1.2.2 凝胶性
  •     1.2.3 持水力
  •     1.2.4 粘弹性
  •   1.3 MTG在食品工业中的应用
  •     1.3.1 肉制品
  •     1.3.2 乳制品
  •     1.3.3 谷物产品
  •     1.3.4 豆制品
  •   1.4 MTG的生产研究进展
  •     1.4.1 野生菌的发酵生产
  •     1.4.2 重组菌株的发酵生产
  •   1.5 枯草芽孢杆菌表达系统的概述
  •   1.6 乳酸乳球菌表达系统的概述
  •   1.7 课题研究目的意义及主要内容
  •     1.7.1 立题依据及意义
  •     1.7.2 主要研究内容
  • 第二章 茂源链霉菌来源的MTG在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 菌株和质粒
  •     2.1.2 材料与试剂
  •     2.1.3 实验仪器
  •     2.1.4 培养基和主要溶液的配制
  •     2.1.5 本章所用引物及其特征
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 感受态细胞的制备
  • mtg的构建'>    2.2.2 重组表达载体pMA5mtg的构建
  • mtg增的构建'>    2.2.3 重组表达载体pHT43mtg增的构建
  •     2.2.4 重组MTG-His表达菌株生长曲线的测定
  • wapA-MTG-6His的组成型表达和纯化'>    2.2.5 重组SPwapA-MTG-6His的组成型表达和纯化
  • amyQ-MTG-6His的诱导表达和纯化'>    2.2.6 重组SPamyQ-MTG-6His的诱导表达和纯化
  •     2.2.7 诱导剂浓度的优化
  •     2.2.8 蛋白质的纯化与活化
  •     2.2.9 MTG-6His的酶活力测定
  •     2.2.10 大豆蛋白的交联反应
  •   2.3 数据处理
  •   2.4 结果与分析
  • mtg增的构建'>    2.4.1 重组表达载体pMA5mtg增的构建
  • mtg增的构建'>    2.4.2 重组表达载体pHT43mtg增的构建
  • wapA能够指导MTG-6His在B.subtilis中的分泌'>    2.4.3 SPwapA能够指导MTG-6His在B.subtilis中的分泌
  • amyQ能够指导MTG-6His在B.subtilis中的分泌'>    2.4.4 SPamyQ能够指导MTG-6His在B.subtilis中的分泌
  •     2.4.5 IPTG诱导剂浓度的优化
  •     2.4.6 MTG-6His的表达对B.subtilis的生长无明显影响
  •     2.4.7 B.subtilis产生有功能活性的MTG
  •     2.4.8 成熟MTG-6His与大豆分离蛋白的交联反应
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 茂源链霉菌来源的MTG在乳酸乳球菌中的分泌表达
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 菌株和质粒
  •     3.1.2 材料与试剂
  •     3.1.3 实验仪器
  •     3.1.4 培养基和主要溶液的配制
  •     3.1.5 本章所用引物及其特征
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 感受态细胞的制备
  • usp45-promtg的构建'>    3.2.2 重组表达载体pNZ8048-SPusp45-promtg的构建
  • p5-SPusp45（K2A）-promtg的构建'>    3.2.3 重组表达载体pNZ8048-Pp5-SPusp45（K2A）-promtg的构建
  •     3.2.4 重组MTG-His表达菌株生长曲线的测定
  • usp45-MTG-6His的组成型表达和纯化'>    3.2.5 重组SPusp45-MTG-6His的组成型表达和纯化
  • usp45-MTG-6His的诱导表达和纯化'>    3.2.6 重组SPusp45-MTG-6His的诱导表达和纯化
  •     3.2.7 诱导剂浓度的优化
  •     3.2.8 蛋白质的纯化与活化
  •     3.2.9 MTG-6His的酶活力测定
  •     3.2.10 大豆蛋白的交联反应
  •   3.3 数据处理
  •   3.4 结果与分析
  • usp45-promtg的构建'>    3.4.1 重组表达载体pNZ8048-SPusp45-promtg的构建
  • p5-SPusp45（K2A）-promtg的构建'>    3.4.2 重组表达载体pNZ8048-Pp5-SPusp45（K2A）-promtg的构建
  • usp45 （K2A）能够指导pro-MTG-6His在L.lactis中的分泌'>    3.4.3 SPusp45（K2A）能够指导pro-MTG-6His在L.lactis中的分泌
  • usp45能够指导pro-MTG-6His在L.lactis中的分泌'>    3.4.4 SPusp45能够指导pro-MTG-6His在L.lactis中的分泌
  •     3.4.5 Nisin诱导剂浓度的优化
  •     3.4.6 pro-MTG-6His的表达对L.lactis的生长无明显影响
  •     3.4.7 L.lactis产生有功能活性的MTG
  •     3.4.8 pro-MTG-6His水解产生的MTG-6His可以适当的交联SPI
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 MTG在乳酸乳球菌中的生产优化
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 菌株和质粒
  •     4.1.2 材料与试剂
  •     4.1.3 实验仪器
  •     4.1.4 培养基和主要溶液的配制
  •     4.1.5 本章所用引物及其特征
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 感受态细胞的制备
  • usp45-promtg-mature-mtg的构建'>    4.2.2 重组表达载体pNZ8048-SPusp45-promtg-mature-mtg的构建
  •     4.2.3 重组MTG-His表达菌株生长曲线的测定
  •     4.2.4 Mature MTG在L.lactis中的胞内表达
  •     4.2.5 pro-MTG-6His在L.lactis中的胞外表达
  •     4.2.6 MTG-6His的酶活力测定
  •   4.3 数据处理
  •   4.4 结果与分析
  • usp45-promtg-mature-mtg的构建'>    4.4.1 重组表达载体pNZ8048-SPusp45-promtg-mature-mtg的构建
  •     4.4.2 Mature MTG可以促进L.lactis的生长
  •     4.4.3 Mature MTG在L.lactis中的胞内表达
  •     4.4.4 pro-MTG-6His在L.lactis中的胞外表达
  •     4.4.5 MTG-6His的酶活力测定
  •   4.5 本章小结
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 本文创新点
  •   5.3 展望
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陆姣姣

    导师: 郑志,穆冬冬

    关键词: 谷氨酰胺转氨酶,枯草芽孢杆菌,乳酸乳球菌,分泌性表达,信号肽

    来源: 合肥工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 合肥工业大学

    分类号: Q78

    总页数: 91

    文件大小: 5713K

    下载量: 124

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