牛乳中蜡样芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及验证

论文摘要

目的建立一种快速检测牛乳中蜡样芽孢杆菌的荧光定量PCR方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的蜡样芽孢杆菌gyrB基因序列及荧光定量PCR要求,设计合适的特异性引物,提取菌体DNA,对目的基因进行扩增及克隆;以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线;以蜡样芽孢杆菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。对建立的方法进行特异性及灵敏性验证。结果建立的方法检测其他3种牛乳中常见致病菌（大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌）未见特异性扩增,即无交叉反应;最低检出限为1×10-7 ng/μL。以掺入蜡样芽孢杆菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中10. 4 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌,优于国标方法（GB 4789. 14-2014）检测含有相同菌落数的蜡样芽孢杆菌（仅能检测到1. 04×102CFU/mL）。结论建立的方法特异性强,灵敏性高,适用于快速、准确检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌,为实验室快速检测致病菌提供了参考。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株及质粒
•   1.2 主要试剂及仪器
•   1.3 荧光定量PCR检测方法的建立
•     1.3.1 菌株培养及DNA模板的制备
•     1.3.2 引物设计及合成
•     1.3.3 目的基因的扩增及克隆
•     1.3.4 重组质粒标准曲线的绘制
•   1.4 方法的验证
•     1.4.1 特异性
•     1.4.2灵敏性
•     1.4.3 模拟标本的检测
• 2 结果
•   2.1 gyrB基因片段扩增及克隆产物的鉴定
•   2.2 荧光定量PCR扩增结果
•   2.3 方法的验证
•     2.3.1 特异性
•     2.3.2 灵敏性
•     2.3.3 含菌乳样的检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 杨健,侯婷婷,佐兆杭,郭瑜,姚笛

关键词: 荧光定量,蜡样芽孢杆菌,基因

来源: 中国生物制品学杂志 2019年03期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,工程科技Ⅰ辑

专业: 轻工业手工业

单位: 黑龙江八一农垦大学食品学院

基金: 大庆市指导性科技计划项目(zd-2016-147)

分类号: TS252.7

DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.002520

页码: 324-327+332

总页数: 5

文件大小: 322K

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